1. a) tanaman c3 merupakan tanaman yang hidup pada lingkungan subtropis dimana intensitas cahaya yang dibutuhkan untuk fotosintesis tidak terlalu tinggi namun juga tidak terlalu rendah. Pada grafik dapat dilihat semakin tinggi intensitas cahaya maka asimilasi yang dihasilkan dari proses fotosintesis akan menurun. Hal ini dapat disebabkan karena pada tanaman c3 memiliki kompensasi cahaya yang rendah sehingga apabila tanaman c3 mendapatkan intensitas cahaya yang tinggi maka akan mengakibatkan tanaman menjadi stress yang dapat berdampak salah satunya terhadap stomata. Stomata dapat menutup sehingga laju fotoresipirasi akan meningkat. Meningkatnya fotorespirasi akan menyebabkan kompetisi antara co2 dan 02 pada tanaman dalam berikatan dengan enzim rubisco. Kompetisi ini akan mempengaruhi proses fotosintesis pada tanaman c3.
b) pada tanaman c4, merupakan tanamann yang hidup pada lingkunan tropis dimana tanaman c4 tahan terhadap intensitas cahaya tinggi. Pada tabel dapat dilihat bahwa semakin tinggi intensitas cahaya makan laju asimilasi dari proses fotosentesis akan ikut meningkat. Hal ini dikarenakan pada tanaman c4, proses fotosintesisnya terbagi menjadi 2 tempat yaitu sel mesofil (reaksi terang) dan sel seludang pembuluh (reaksi gelap). Co2 sebagai bahan baku fotosintesis di tambat oleh PEP di mesofil yang kemudian ditransfer ke sel seludang pembuluh dimana co2 tadi akan diikat kembali oleh rubisco. Pada sel seludang pembuluh, konsentrasi c02 sangat tinggi sehingga enzim rubisco hanya akan menambat co2 (tidak terjadi kompetisi antara o2 danco2 dalam mengikat rubisco), hal ini mnyebabkan fotorespirasi yang terjadi sangat kecil sekali bahkan tidak terjadi sama sekali. Cahaya pada proses fotosintesis berfungsi dalam mengaktifkan enzim rubisco, yang dalam kasus ini semakin tinggi intensitas cahaya, semakin tinggi enzim rubisco yang dihasilkan, meningkatnya enzim rubisco yang aktif akan meningkatkan jumlah co2 yang ditambat yang berpengaruh pada meningkatnya hasil fotosintesis.
c) pengaruh intensitas cahaya terhadap ketebaan daun adalah daun yang mendapatkan intensitas cahaya yang tinggi akan memiliki ketebalan daun yang lebih tebal dibandingkan dengan daun yang mendapatkan intesitas cahaya yang rendah. Hal ini dpat dikarenakan pada daun yang mendapatkan intensitas cahaya yang tinggi akan menyebabkan kapasitas fotosintesis meningkat dan menyebabkan laju asimilasi pada daun ikut meningkat. Selain itu pada daun yang terkena intensitas cahaya yang tinggi akan membentuk lapisan palisade yang lebih panjang/lapisan palisade tambahan yang menybabkan menebalnya ketebalan daun.
d) pengaruh intensitas cahaya pada jumlah klorofil daun......
2. Pengaruh faktor suhu bagi laju respirasi tumbuhan sangat terkait dengan faktor Q10, dimana umumnya laju reaksi respirasi akan meningkat untuk setiap kenaikan suhu sebesar 10oC, namun hal ini tergantung pada masing-masing spesies. Q10 (temperature koefesient) merupakan interval peningkatan yang berpengaruh terhadap respirasi. Peningkatan respirasi berbanding lurus dengan peningkatan temperatur. Bagi sebagian besar bagian tumbuhan dan spesies tumbuhan, Q10 respirasi biasanya 2,0 sampai 2,5 pada suhu antara 5 dan 25°C. Bila suhu meningkat lebih jauh sampai 30 atau 35°C, laju respirasi tetap meningkat, tapi lebih lambat, jadi Q10 mulai menurun. Penjelasan tentang penurunan Q10 pada suhu yang tinggi ini adalah bahwa laju penetrasi O2 ke dalam sel lewat kutikula atau periderma mulai menghambat respirasi saat reaksi kimia berlangsung dengan cepat. Difusi O2 dan CO2 juga dipercepat dengan peningkatan suhu, tapi Q10 untuk proses fisika ini hanya 1,1 ; jadi suhu tidak mempercepat secara nyata difusi larutan lewat air. Peningkatan suhu sampai 40°C atau lebih, laju respirasi malahan menurun, khususnya bila tumbuhan berada pada keadaan ini dalam jangka waktu yang lama. Nampaknya enzim yang diperlukan mulai mengalami denaturasi dengan cepat pada suhu yang tinggi, mencegah peningkatan metabolik yang semestinya terjadi. Pada kecambah kacang kapri, peningkatan suhu dari 25 menjadi 45°C mula-mula meningkatkan respirasi dengan cepat, tapi setelah dua jam lajunya mulai berkurang. Kemungkinan penjelasannya ialah jangka waktu dua jam sudah cukup lama untuk merusak sebagian enzim respirasi. (Salisbury & Ross, 1995)
Suhu perpengaruh thdp sistem enzim yang mengkatalisis respirasi. Beberapa golongan tumbuhan menunjukkan respon yang berbeda terhadap perlakuan temperatur dalam jangka waktu pendek.
3. Pada tumbuhan, hasil fotosintesis diakumulasi dalam bentuk sukrosa atau pati sedangkan glukosa dan fruktosa konsentrasinya jauh lebih rendah.
Sukrosa: senyawa penting sebagai sumber energi pada sel fotosintetik dan ditranslokasikan melalui pembuluh floem trtm ke jaringan yang sedang tumbuh.
Sintesa sukrose di sitosol bukan di kloroplas; triose fosfat sebagai prekursor.
Tempat gula dihasilkan disebut sebagai sumber gula (sugar source)
Tempat gula disimpan atau dikonsumsi disebut sebagai sugar sink
Contoh sugar sink: akar,ujung batang, buah yang sedang tumbuh, jaringan cadangan makanan,dll
Gula bergerak dari sugar source ke sugar sink dengan mekanisme aliran massa
Pada bagian sugar source:
Gula diangkut masuk ke tabung floem melalui transport aktif;
Konsentrasi larutan yang tinggi menarik air secara difusi
Pada bagian sugar sink:
Saat gula meninggalkan floem,
Air akan mengikuti keluar melalui osmosis.
Xilem akan mengangkut air kembali dr sugar sink ke sugar source.
Rabu, 02 November 2011
Selasa, 01 November 2011
• BIOTEKNOLOGI
• Pengertian Bioteknologi
• Pemanfaatan organisme hidup untuk menghasilkan produk dan jasa yang bermanfaat bagi manusia
• PETA KONSEP
• Perbandingan Bioteknologi Konvensional dan Modern
• SEJARAH SINGKAT PERKEMBANGAN BIOTEKNOLOGI
• Ragi untuk pembuatan anggur (< 6000 SM) • Ragi untuk mengembangkan roti (± 4500 SM) • Tembaga ditambang dengan mikroba di Spanyol (< 1670) • Mikroba pertama kali dilihat oleh Leewenhoek (1680) • Mikroba perusak fermentasi ditemukan Louis Pasteur (1876) • Enzim diekstrak dari ragi dapat membuat alkohol ditemukan Eduard Buchner (1897) • Penemuan bakteri penghasil aseton, butanol, gliserol (± 1910) • Struktur rantai ganda ADN terungkap (1953) • Penemuan bakteri antibiotik baru : streptomisin, sefalosporin, dll (1953) • Mikroba digunakan menambang uranium di Kanada (1960-an) • Ditemukan ADN rekombinan dan percobaan rekayasa genetik pertama berhasil (1973) • Hibridoma menghasilkan antibodi monoklonal (1973) • Bahan mentah industri plastik dari mikroba, interferon untuk kanker (80-an) • Mikroba hasil rekayasa membantu mengekstrak minyak dari tanah mikroba secara luas digunakan untuk mengekstrak logam, produksi hidrogen dari bakteri, Antibodi monoklonal digunakan untuk menuntun obat anti kanker, membuat tanaman yang memupuk sendiri dan tanaman yang mampu menolak serangan hama sendiri, lewat rekayasa genetika (1990-an) • KULTUR JARINGAN • Adalah Teknik untuk memperoleh bibit tanaman dengan cara menumbuhkan sebagian jaringan tumbuhan dalam media khusus. • Teori yang melandasi teknik ini adalah teori totipotensi, • yang artinya setiap sel tumbuhan memiliki kemampuan • untuk tumbuh menjadi individu bila ditempatkan pada • lingkungan yang sesuai. • KULTUR JARINGAN • KULTUR JARINGAN • ALAT-ALAT UNTUK KULTUR JARINGAN • REKAYASA GENETIK • Adalah mengubah susunan gen untuk mengubah sifat organisme sehingga memiliki kemampuan yg diinginkan • Teknik Rekayasa genetik: • Fusi Genetik • Fusi protoplasma • Amplifikasi gen • Teknologi Rekombinasi Gen (DNA) • Pembuatan Hibridoma • FUSI GENETIK • Fusi genetik memungkinkan terjadinya pemin-dahan gen (transposisi)dari satu lokasi dalam kromosom ke lokasi yang lain. • Contoh: • Rekayasa terhadap bakteri Pseudomonas syringe yang menyebabkan tanaman tomat dan kentang tahan terhadap suhu beku dibawah -5oC • FUSI PROTOPLASMA Penyatuan dua protoplasma akan memungkin-kan dua sel bergabung dan diikuti penggabung-an materi genetiknya. Penggabungan proto-plasma dua jenis sel yang berbeda akan meng-hasilkan individu baru yang memiliki sifat gabungan kedua sel induk. Contoh: Fusi protoplasma pada bakteri Nocardia lactamdurans yang menghasilkan antibiotik cephalomycin. • REKOMBINASI GEN • Rekombinasi gen dilakukan dengan memotong DNA dan kemudian disambung dengan DNA baru yang membawa sifat unggul. • Tahap-tahap pembuatan DNA Rekombinan • 1 Mula-mula orang mencari DNA unggul, misalnya diambil dari makhluk hidup lain atau membuatnya. Orang pada saat sekarang sudah berhasil membuat DNA ini. • Menyiapkan wahana (vektor), yaitu alat untuk memasukkan DNA itu ke dalam makhluk hidup yang akan diubah sifatnya. Wahana biasanya berupa virus atau plasmid dari bakteri. Plasmid adalah DNA yang bentuknya melingkar, terdapat di luar DNA inti bakteri. DNA plasmid mampu keluar masuk sel dan bisa bergabung dengan kromosom sel organisme lain. • Memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel. • Kloning (perbanyakan) DNA rekombinan. DNA yang sudah dimasukkan ke dalam sel, diperlakukan sedemikian rupa sehingga bakteri yang dimasuki DNA itu menggan-dakan DNA tersebut di dalam selnya. • Kloning (perbanyakan) DNA rekombinan. DNA yang sudah dimasukkan ke dalam sel, diperlakukan sedemikian rupa sehingga bakteri yang dimasuki DNAitu menggan-dakan DNA tersebut di dalam selnya. • PROSES REKOMBINASI DNA • ORGANISME HASIL REKAYASA GENETIK • DAMPAK POSITIF BIOTEKNOLOGI • Peningkatan produksi pangan • Peningkatan kesehatan • Penyedia bahan bakar alternatif • DAMPAK NEGATIF BIOTEKNOLOGI • Di bidang Etika/ Moral o Ada masyarakat yang menganggap bahwa menyisipkan gen suatu MH ke MH berten-tangan dengan nilai budaya dan melanggar hukum alam • Di bidang sosial ekonomi o Menimbulkan kesenjangan antara negara/ perusahaan yang memanfaatkan biotekno-logi dengan yang belum memanfaatkan bioteknologi (negara dunia ke tiga) • Dampak di bidang kesehatan o Ada produk hasil rekayasa genetik yang disinyalir menimbulkan masalah serius, misalnya kematian akibat penggunaan insulin, sapi penghasil susu yang disuntik dengan Hormon BGH mengandung bahan kimia yang berbahaya, tomat Flavr Savr diketahui membawa gen resisten terhadap antibiotik. • Dampak terhadap lingkungan o Pelepasan organisme transgenik ke alam dapat keseimbangan alam dan kelestarian organisme. Bioplastics Produced by Microorganisms Importance 2003- North America 107 billion pounds of synthetic plastics produced from petroleum Take >50 years to degrade
Improper disposal and failure to recycle overflowing landfills
Degradable polymers that are naturally degraded by the action of microorganisms such as bacteria, fungi and algae
Carbon Cycle of Bioplastics
Polyhydroxyalkanoates (PHAs)
Polyesters accumulated inside microbial cells as carbon & energy source storage
Polyhydroxyalkanoates (PHAs)
Produced under conditions of:
Low limiting nutrients (P, S, N, O)
Excess carbon
"Bacterial Polyester"
Polyhydroxybutyrate (PHB)
Example of short-chain-length PHA
Produced in activated sludge
Found in Alcaligenes eutrophus
Accumulated intracellularly as granules (>80% cell dry weight)
PHA Biosynthesis
phbC-A-B Operon in A. eutrophus
Structural genes encoded in single operon
PHA synthase
-ketothiolase
NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase
PHB biosynthesis
PHB-Cycle
Production of PHA in Bacteria
PHAs
PHA-Synthesis in Bakteri vs Transgenic Plants
Accumulation of PHA in transgenic A. thaliana
Synthesis of PHBV-Copolymers in Plants
Bioplastics
Recovery of PHAs from Cells
PHA producing microorganisms stained with Sudan black or Nile blue
Cells separated out by centrifugation or filtration
PHA is recovered using solvents (chloroform) to break cell wall & extract polymer
Purification of polymer
Bioplastic Properties
Some are stiff and brittle
Crystalline structure rigidity
Some are rubbery and moldable
Properties may be manipulated by blending polymers or genetic modifications
Degrades at 185°C
Moisture resistant, water insoluble, optically pure, impermeable to oxygen
Must maintain stability during manufacture and use but degrade rapidly when disposed of or recycled
Biodegradation
Fastest in anaerobic sewage and slowest in seawater
Depends on temperature, light, moisture, exposed surface area, pH and microbial activity
Degrading microbes colonize polymer surface & secrete PHA depolymerases
PHA CO2 + H2O (aerobically)
PHA CO2 + H2O + CH4 (anaerobically)
Biodegradation by
PHA depolymerases
Controlled Degradation
Agriculture Biotechnology
What Is Biotechnology?
Using scientific methods with organisms to produce new products or new forms of organisms
Any technique that uses living organisms or substances from those organisms to make or modify a product, to improve plants or animals, or to develop microorganisms for specific uses
What Is Biotechnology?
GMO- genetically modified organisms.
GEO- genetically enhanced organisms.
With both, the natural genetic material of the organism has been altered.
Roots in bread making, wine brewing, cheese and yogurt fermentation, and classical plant and animal breeding
What Is Biotechnology?
Manipulation of genes is called genetic engineering or recombinant DNA technology
Genetic engineering involves taking one or more genes from a location in one organism and either
Transferring them to another organism
Putting them back into the original organism in different combinations
Genetic Engineering
Manipulating an organism’s genome to
alter microbes, plants, and animals for our benefit
correct genetic defects in humans
Genetically Modified Organisms
Herbicide-resistant plants
Bt cotton/corn (toxin gene from Bacillus thuringiensis that kills insects)
Flavr-Savr tomatoes
Golden rice (beta-carotene)
Plant-based vaccines
Golden Rice- Agrobiotech
Golden rice is the result of an effort to develop rice varieties that produce provitamin-A (beta-carotene) as a means of alleviating vitamin A (retinol) deficiencies in the diets of poor and disadvantaged people in developing countries. Because traditional rice varieties do not produce provitamin-A, transgenic technologies were required.
Insect Resistance
B. thuringiensis (commonly known as 'Bt') is an insecticidal bacterium, marketed worldwide for control of many important plant pests - mainly caterpillars of the Lepidoptera (butterflies and moths) but also mosquito larvae, and simuliid blackflies that vector river blindness in Africa. Bt products represent about 1% of the total ‘agrochemical’ market (fungicides, herbicides and insecticides)
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens causes crown gall disease by first transferring part of its DNA into an opening in the plant. The DNA then integrates itself into the plant's genome and causes the formation of the gall.
Crown Gall – Plant tumor
How Does Agrobacterium Gene Transfer Work?
Extract DNA from donor
Cut DNA into fragments
Sort DNA fragments
Recombine DNA fragments
Transfer plasmids with bonded DNA
Grow transformed (recipient) cells
Agrobacterium tumefaciens
Vaccines
Bananas have potential to become the world's first edible vaccine due to Agrobacterium. An edible vaccine doesn't need sterile syringes, costly refrigeration, or multiple injections. According to the World Health Organization (WHO), more than 2 million children die worldwide each year from diarrhea that can be prevented easily with vaccines. Thus, researchers lead by Dr. Charles Arntzen are looking into making the food vaccines to prevent diarrhea caused by Escherichia coli and Vibrio cholara bacteria.
pGlo – Gfp
Green fluorescent protein
Fluorescent
In the laboratory, fluorescence is easily achieved by exposing the protein to long range UV light or “ black" light.
The fluorophore absorbs light in the UV-B region (395 nm.. plus a smaller absorbance peak at 470 nm)
It emits light (fluoresces) at 509 nm, which is in the green part of the visible spectrum
Gfp and Land Mines
Neal Stewart at the University of North Carolina is developing plants that can detect land mines
Plants could be ideal biosensors for land mines as seeds would be spread widely and evenly in a suspect field
The gene that can announce the presence of land mines is gfp
The gene will be expressed in the presence of a land mine
What is Agriscience?
Agriculture - The production, processing, and marketing of food, fiber, and renewable natural resources.
Production involves the actual producing of the food and fiber, this are includes all of the inputs necessary for production and all of the production labor.
Grain, Livestock, and Fruit Farming
Chemicals, fertilizers, & supporting agribusiness
What Are Methods of Classical Biotechnology?
Plant breeding methods;
Line breeding- breeding successive generations of plants among themselves
Crossbreeding- breeding plants of different varieties or species
Hybridization- breeding individuals from two distinctly different varieties
Selection
Why Are Plants Genetically Engineered?
Resist pests
Resist herbicides
Improved product quality
Pharmaceuticals
Industrial products
What Is Composting?
Composting- a process that promotes biological decomposition of organic matter
Compost bin- a facility that contains materials for composting
In-vessel composting- using enclosed containers for composting
• Pengertian Bioteknologi
• Pemanfaatan organisme hidup untuk menghasilkan produk dan jasa yang bermanfaat bagi manusia
• PETA KONSEP
• Perbandingan Bioteknologi Konvensional dan Modern
• SEJARAH SINGKAT PERKEMBANGAN BIOTEKNOLOGI
• Ragi untuk pembuatan anggur (< 6000 SM) • Ragi untuk mengembangkan roti (± 4500 SM) • Tembaga ditambang dengan mikroba di Spanyol (< 1670) • Mikroba pertama kali dilihat oleh Leewenhoek (1680) • Mikroba perusak fermentasi ditemukan Louis Pasteur (1876) • Enzim diekstrak dari ragi dapat membuat alkohol ditemukan Eduard Buchner (1897) • Penemuan bakteri penghasil aseton, butanol, gliserol (± 1910) • Struktur rantai ganda ADN terungkap (1953) • Penemuan bakteri antibiotik baru : streptomisin, sefalosporin, dll (1953) • Mikroba digunakan menambang uranium di Kanada (1960-an) • Ditemukan ADN rekombinan dan percobaan rekayasa genetik pertama berhasil (1973) • Hibridoma menghasilkan antibodi monoklonal (1973) • Bahan mentah industri plastik dari mikroba, interferon untuk kanker (80-an) • Mikroba hasil rekayasa membantu mengekstrak minyak dari tanah mikroba secara luas digunakan untuk mengekstrak logam, produksi hidrogen dari bakteri, Antibodi monoklonal digunakan untuk menuntun obat anti kanker, membuat tanaman yang memupuk sendiri dan tanaman yang mampu menolak serangan hama sendiri, lewat rekayasa genetika (1990-an) • KULTUR JARINGAN • Adalah Teknik untuk memperoleh bibit tanaman dengan cara menumbuhkan sebagian jaringan tumbuhan dalam media khusus. • Teori yang melandasi teknik ini adalah teori totipotensi, • yang artinya setiap sel tumbuhan memiliki kemampuan • untuk tumbuh menjadi individu bila ditempatkan pada • lingkungan yang sesuai. • KULTUR JARINGAN • KULTUR JARINGAN • ALAT-ALAT UNTUK KULTUR JARINGAN • REKAYASA GENETIK • Adalah mengubah susunan gen untuk mengubah sifat organisme sehingga memiliki kemampuan yg diinginkan • Teknik Rekayasa genetik: • Fusi Genetik • Fusi protoplasma • Amplifikasi gen • Teknologi Rekombinasi Gen (DNA) • Pembuatan Hibridoma • FUSI GENETIK • Fusi genetik memungkinkan terjadinya pemin-dahan gen (transposisi)dari satu lokasi dalam kromosom ke lokasi yang lain. • Contoh: • Rekayasa terhadap bakteri Pseudomonas syringe yang menyebabkan tanaman tomat dan kentang tahan terhadap suhu beku dibawah -5oC • FUSI PROTOPLASMA Penyatuan dua protoplasma akan memungkin-kan dua sel bergabung dan diikuti penggabung-an materi genetiknya. Penggabungan proto-plasma dua jenis sel yang berbeda akan meng-hasilkan individu baru yang memiliki sifat gabungan kedua sel induk. Contoh: Fusi protoplasma pada bakteri Nocardia lactamdurans yang menghasilkan antibiotik cephalomycin. • REKOMBINASI GEN • Rekombinasi gen dilakukan dengan memotong DNA dan kemudian disambung dengan DNA baru yang membawa sifat unggul. • Tahap-tahap pembuatan DNA Rekombinan • 1 Mula-mula orang mencari DNA unggul, misalnya diambil dari makhluk hidup lain atau membuatnya. Orang pada saat sekarang sudah berhasil membuat DNA ini. • Menyiapkan wahana (vektor), yaitu alat untuk memasukkan DNA itu ke dalam makhluk hidup yang akan diubah sifatnya. Wahana biasanya berupa virus atau plasmid dari bakteri. Plasmid adalah DNA yang bentuknya melingkar, terdapat di luar DNA inti bakteri. DNA plasmid mampu keluar masuk sel dan bisa bergabung dengan kromosom sel organisme lain. • Memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel. • Kloning (perbanyakan) DNA rekombinan. DNA yang sudah dimasukkan ke dalam sel, diperlakukan sedemikian rupa sehingga bakteri yang dimasuki DNA itu menggan-dakan DNA tersebut di dalam selnya. • Kloning (perbanyakan) DNA rekombinan. DNA yang sudah dimasukkan ke dalam sel, diperlakukan sedemikian rupa sehingga bakteri yang dimasuki DNAitu menggan-dakan DNA tersebut di dalam selnya. • PROSES REKOMBINASI DNA • ORGANISME HASIL REKAYASA GENETIK • DAMPAK POSITIF BIOTEKNOLOGI • Peningkatan produksi pangan • Peningkatan kesehatan • Penyedia bahan bakar alternatif • DAMPAK NEGATIF BIOTEKNOLOGI • Di bidang Etika/ Moral o Ada masyarakat yang menganggap bahwa menyisipkan gen suatu MH ke MH berten-tangan dengan nilai budaya dan melanggar hukum alam • Di bidang sosial ekonomi o Menimbulkan kesenjangan antara negara/ perusahaan yang memanfaatkan biotekno-logi dengan yang belum memanfaatkan bioteknologi (negara dunia ke tiga) • Dampak di bidang kesehatan o Ada produk hasil rekayasa genetik yang disinyalir menimbulkan masalah serius, misalnya kematian akibat penggunaan insulin, sapi penghasil susu yang disuntik dengan Hormon BGH mengandung bahan kimia yang berbahaya, tomat Flavr Savr diketahui membawa gen resisten terhadap antibiotik. • Dampak terhadap lingkungan o Pelepasan organisme transgenik ke alam dapat keseimbangan alam dan kelestarian organisme. Bioplastics Produced by Microorganisms Importance 2003- North America 107 billion pounds of synthetic plastics produced from petroleum Take >50 years to degrade
Improper disposal and failure to recycle overflowing landfills
Degradable polymers that are naturally degraded by the action of microorganisms such as bacteria, fungi and algae
Carbon Cycle of Bioplastics
Polyhydroxyalkanoates (PHAs)
Polyesters accumulated inside microbial cells as carbon & energy source storage
Polyhydroxyalkanoates (PHAs)
Produced under conditions of:
Low limiting nutrients (P, S, N, O)
Excess carbon
"Bacterial Polyester"
Polyhydroxybutyrate (PHB)
Example of short-chain-length PHA
Produced in activated sludge
Found in Alcaligenes eutrophus
Accumulated intracellularly as granules (>80% cell dry weight)
PHA Biosynthesis
phbC-A-B Operon in A. eutrophus
Structural genes encoded in single operon
PHA synthase
-ketothiolase
NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase
PHB biosynthesis
PHB-Cycle
Production of PHA in Bacteria
PHAs
PHA-Synthesis in Bakteri vs Transgenic Plants
Accumulation of PHA in transgenic A. thaliana
Synthesis of PHBV-Copolymers in Plants
Bioplastics
Recovery of PHAs from Cells
PHA producing microorganisms stained with Sudan black or Nile blue
Cells separated out by centrifugation or filtration
PHA is recovered using solvents (chloroform) to break cell wall & extract polymer
Purification of polymer
Bioplastic Properties
Some are stiff and brittle
Crystalline structure rigidity
Some are rubbery and moldable
Properties may be manipulated by blending polymers or genetic modifications
Degrades at 185°C
Moisture resistant, water insoluble, optically pure, impermeable to oxygen
Must maintain stability during manufacture and use but degrade rapidly when disposed of or recycled
Biodegradation
Fastest in anaerobic sewage and slowest in seawater
Depends on temperature, light, moisture, exposed surface area, pH and microbial activity
Degrading microbes colonize polymer surface & secrete PHA depolymerases
PHA CO2 + H2O (aerobically)
PHA CO2 + H2O + CH4 (anaerobically)
Biodegradation by
PHA depolymerases
Controlled Degradation
Agriculture Biotechnology
What Is Biotechnology?
Using scientific methods with organisms to produce new products or new forms of organisms
Any technique that uses living organisms or substances from those organisms to make or modify a product, to improve plants or animals, or to develop microorganisms for specific uses
What Is Biotechnology?
GMO- genetically modified organisms.
GEO- genetically enhanced organisms.
With both, the natural genetic material of the organism has been altered.
Roots in bread making, wine brewing, cheese and yogurt fermentation, and classical plant and animal breeding
What Is Biotechnology?
Manipulation of genes is called genetic engineering or recombinant DNA technology
Genetic engineering involves taking one or more genes from a location in one organism and either
Transferring them to another organism
Putting them back into the original organism in different combinations
Genetic Engineering
Manipulating an organism’s genome to
alter microbes, plants, and animals for our benefit
correct genetic defects in humans
Genetically Modified Organisms
Herbicide-resistant plants
Bt cotton/corn (toxin gene from Bacillus thuringiensis that kills insects)
Flavr-Savr tomatoes
Golden rice (beta-carotene)
Plant-based vaccines
Golden Rice- Agrobiotech
Golden rice is the result of an effort to develop rice varieties that produce provitamin-A (beta-carotene) as a means of alleviating vitamin A (retinol) deficiencies in the diets of poor and disadvantaged people in developing countries. Because traditional rice varieties do not produce provitamin-A, transgenic technologies were required.
Insect Resistance
B. thuringiensis (commonly known as 'Bt') is an insecticidal bacterium, marketed worldwide for control of many important plant pests - mainly caterpillars of the Lepidoptera (butterflies and moths) but also mosquito larvae, and simuliid blackflies that vector river blindness in Africa. Bt products represent about 1% of the total ‘agrochemical’ market (fungicides, herbicides and insecticides)
Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens causes crown gall disease by first transferring part of its DNA into an opening in the plant. The DNA then integrates itself into the plant's genome and causes the formation of the gall.
Crown Gall – Plant tumor
How Does Agrobacterium Gene Transfer Work?
Extract DNA from donor
Cut DNA into fragments
Sort DNA fragments
Recombine DNA fragments
Transfer plasmids with bonded DNA
Grow transformed (recipient) cells
Agrobacterium tumefaciens
Vaccines
Bananas have potential to become the world's first edible vaccine due to Agrobacterium. An edible vaccine doesn't need sterile syringes, costly refrigeration, or multiple injections. According to the World Health Organization (WHO), more than 2 million children die worldwide each year from diarrhea that can be prevented easily with vaccines. Thus, researchers lead by Dr. Charles Arntzen are looking into making the food vaccines to prevent diarrhea caused by Escherichia coli and Vibrio cholara bacteria.
pGlo – Gfp
Green fluorescent protein
Fluorescent
In the laboratory, fluorescence is easily achieved by exposing the protein to long range UV light or “ black" light.
The fluorophore absorbs light in the UV-B region (395 nm.. plus a smaller absorbance peak at 470 nm)
It emits light (fluoresces) at 509 nm, which is in the green part of the visible spectrum
Gfp and Land Mines
Neal Stewart at the University of North Carolina is developing plants that can detect land mines
Plants could be ideal biosensors for land mines as seeds would be spread widely and evenly in a suspect field
The gene that can announce the presence of land mines is gfp
The gene will be expressed in the presence of a land mine
What is Agriscience?
Agriculture - The production, processing, and marketing of food, fiber, and renewable natural resources.
Production involves the actual producing of the food and fiber, this are includes all of the inputs necessary for production and all of the production labor.
Grain, Livestock, and Fruit Farming
Chemicals, fertilizers, & supporting agribusiness
What Are Methods of Classical Biotechnology?
Plant breeding methods;
Line breeding- breeding successive generations of plants among themselves
Crossbreeding- breeding plants of different varieties or species
Hybridization- breeding individuals from two distinctly different varieties
Selection
Why Are Plants Genetically Engineered?
Resist pests
Resist herbicides
Improved product quality
Pharmaceuticals
Industrial products
What Is Composting?
Composting- a process that promotes biological decomposition of organic matter
Compost bin- a facility that contains materials for composting
In-vessel composting- using enclosed containers for composting
Selasa, 25 Oktober 2011
Terpenoid, alkaloid, flavonoidddd
TERPENOID
Nama Terpen diberikan trhadap senyawa yg mempunyai perumusan molekul C10H6, secara etimologi berasal dari pohon terebinth (Pistacia terebinthus)
Tanaman conifer, eucalyptus, dan jeruk kaya terpen volatil, dg volatilitas yg mudah dikenal karena berbau harum dikenal dengan minyak essential (minyak atsiri)
Senyawa terpenoid kebanyakan bebas dalam jaringan tanaman, tdk terikat senyawa lain. Namun banyak juga yg terdapat sebagai glikosida, ester dari asam organik & beberapa terikat dg protein
Terpenoid : lipid yang sangat bervariasi struktur dan fungsinya,mulai dari hormon adrenal (kortison), volatile sex pheromones, vit A, D & E sampai ke karet alam
Terpenoid : dibangun oleh satuan C5 isoprena, digolongkan atas monoterpenoid, seskuiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid, tetraterpenoid dan politerpenoid serta terpenoid asiklik
Monoterpenoid : Komponen yang terdapt pada tumbuhan tingkat tinggi dan alga : sebagai attractant dan komponen minyak atsiri
Seskuiterpenoid : pada tumbuhan dan klorofil berbagai bakteri sebagai minyak atsiri dan antibiotik jamur
Diterpenoid : paling penting isoprenoid asiklik fitol, terdapat pada berbagai gliserida eter lipid bakterial sebagai dihidrofitol (fitanol): komponen yang umum pada tumbuhan tingkat tinggi
Triterpenoid : diturunkan dari isoprenoid asiklik skualen
(C30H50), komponen utuh dari minyak ikan, minyak vegetable, jamur.
Pentasiklik triterpenoid : komponen tumbuhan tingkat tinggi
bertipe oleanan, ursan dan lupan serta komponen bakteri
berupa tipe hopan
Berbagai triterpenoid organisme merupakan prekursor langsung
hidrokarbon dalam fosil sedimen dan minyak bumi.
Pentasiklik triterpenoid dengan cincin-E bersisi enam, hanya
terdapat pada tumbuhan tingkat tinggi dan yang bersisi lima hanya terdapat pada bakteri (disebut bakteriohopanoid)
Secara umum biosintesis terpenoid terjadinya melalui 3 reaksi dasar :
1. Pembentukan isopren aktif berasal dari asam
asetat melalui asam mevalonat
2. Penggabungan ekor dan kepala 2 unit isopren
akan membentuk mono-, seskui-, di-, dan
poli-terpenoid
3. Penggabungan ekor dan ekor dari unit C15 atau
C20 menghasilkan triterpenoid dan steroid
Dua bentuk isopren aktif yaitu isopentenil pirofosfat (IPP) dan dimetilalil pirofosfat (DMAPP) harus ada dalam biosintesis terpen dalam organisme. IPP dan DMAPP berasal dari asam mevalonat
Mekanisme pembentukannya melalui jalur asam mevalonat :
As. Asetat teraktifasi oleh koenzim-A membentuk asetil koenzim-A, selanjutnya melakukan kondensasi menghasilkan asam asetoasetil koenzim-A
Asetoasetil koenzim-A mengalami kondensasi lg dg asetil koenzim-A menghasilkan senyawa mevalonil koenzim-A selanjutnya mengalami reduksi menjadi asam mevalonat
Reaksi selanjutnya adalah fosforilasi, eliminasi asam fosfat dan dekarboksilasi menghasilkan IPP yg berisomerisasi menjadi DMAPP oleh enzim isomerase
IPP dan DMAPP sbg unit isopren aktif berkondensasi melalui interaksi kepala ke ekor yang merupakan polimerisasi isopren untuk menghasilkan terpenoid
Biogenetik terpenoid berasal dari isopentenyl-pyrophosphate (IPP) terdiri dari lima atom karbon sebagai batu bata (building block) via jalur asam mevalonat (MVA). Isomer IPP adalah DMAPP (dimethyl allyl pyrophosphate). Kedua molekul tsb bergabung menjadi geranyl-pyrophosphate (GPP), farnesylpyrophosphate (FPP), dan geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP).
Selanjutnya berturut-turut menjadi monoterpena (10 C), seskuiterpena (15 C), dan diterpena (20 C).
SKEMA BIOSINTESIS TERPENOID
FPP SESKUITERPENA
2x
IPP DMAPP Sitosol/ER
===========================
IPP DMAPP Plastida
3x 1x
GPP MONOTERPENA
GGPP DITERPENA
MONOTERPENA
Monoterpena reguler: Berasal dari GPP yang kemudian termodifikasi, mrpk komponen minyak atsiri, dpt berbentuk monosiklik (karvon, kamfor, limonena, dsb); bisiklik (pinena, kamfena, sabi-nena, tuyon, dsb).
Monoterpena ireguler: Berasal dari kondensasi dua DMAPP menjadi krisan-temil PP, terdapat dlm fam. Asteraceae (Artemisia dan Chrysanthemum).
TUMBUHAN YANG MENGANDUNG MONOTERPENA
Simplisia yang mengandung monoterpena reguler biasanya terkandung sebagai komponen minyak atsiri, bersama dengan seskuiterpena, sedangkan monoterpena ireguler terdapat dalam tanaman Chrysanthemum cinerariaefolium, Artemisia cina, Artemisia annua.
Iridoid sebagai glikosida terdapat dalam tumbuhan Heydiotis corymbosa L., Plantago mayor L., Valeriana officinalis L.
Artemisia vulgaris L.
Asteraceae
(Sudamala)
Artemisia cina O. Berg
Asteraceae
SESKUITERPENA
Berasal dari farnesilpirofosfat (FPP), mrpk hasil reaksi adisi IPP dan GPP. Sering dalam bentuk bisiklik, misalnya membentuk germakrena dan mengandung gugus lakton dengan berbagai bioaktivitas.
Tdp sbg komponen minyak atsiri bersama monoterpena.
Selain itu, juga tdp dlm biji Gossypium spp. sbg gosipol (0,3-2%). Pd hewan coba menunjukkan oligospermia (utk KB pria).
MINYAK ATSIRI
Nama sinonim: Minyak penguap, volatile oils, essentiale oils.
Definisi:
Minyak atsiri adalah produk, yang kompleks komponennya, yang berasal dari tumbuhan tertentu.
Penyarian: Dpt menggunakan berbagai cara, misalnya distilasi uap, distilasi uap-air, pengepresan, penyarian dng pelarut organik (solvent)
JENIS EKSTRAK MINYAK ATSIRI
CONCRETE . Ekstrak dengan bau khas didapat bahan segar tumbuhan dengan penyari bukan air.
POMADE. Lemak berparfum didapat dari bunga segar dengan “cold enfleurage” atau “hot enfleurage”.
RESINOID. Ekstrak berbau khas, didapat dari bahan kering yang disari dng penyari nir air. Bahan dasar dapat tumbuhan, hewan, mikrobia, juga hasil fermentasi.
ABSOLUTE . Produk dengan bau khas didapat dari ketiga produk di atas, diekstraksi dng etanol pada suhu tertentu. Hasil penyarian didinginkan, disaring untuk menyingkirkan lilin/lemak, kemudian etanol diuapkan.
DISTRIBUSI (PENYEBARAN)
Minyak atsiri tersebar dlm tumbuhan tinggi sekitar 17.500 jenis. Beberapa marga dari familia a.l. Myrtaceaea, Lauraceae, Rutaceae, Lamiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Cupressaceae, Poaceae, Zingiberaceae, dan Piperaceae.
Minyak atsiri terkumpul pada :
- bunga (bergamot, kenanga, melati, mawar),
- daun (kayuputih, eukaliptus, sereh, pandan
wangi, minyak daun cengkeh)
- buah (anisi, foeniculi, staranise),
- kulit kayu (kayu manis jangan, mesoyi),
- akar (akar wangi),
- kayu (cendana, gaharu), rimpang (jahe, -
temulawak, kunyit), dan biji (pala).
Rosa centifolia L.
Asteraceae
(Mawar)
AKUMULASI MINYAK ATSIRI
Minyak atsiri terkumpul dalam organ tanaman tertentu, misalnya:
dalam sel minyak (Lauraceae dan Zingberaceae),
rambut kelenjar (Lamiaceae=Labiatae),
ruang sekrit (Rutaceae dan Myrtaceae),
saluran sekrit (Apiaceae dan Asteraceae).
FUNGSI
Secara biologi fungsi minyak atsiri bagi tumbuhan belum jelas benar, namun kemungkinan berperan dlm segi ekologi. Misalnya dalam alelopati, minyak atsiri dapat menghambat pertumbuhan tumbuhan di sekelilingnya; menghambat perkecambahan; pelindung terhadap predator, dan penarik hewan (insekta, burung, kelelawar) untuk penyerbukan.
SIFAT FISIKA
Minyak atsiri pada suhu kamar cairan yang mudah menguap, berbeda dengan minyak lemak (fixed oils); biasanya sedikit larut dalam air. Bobot jenis biasanya lebih rendah dari pada air (kecuali Ol. Cinnamomi). Mempunyai indeks bias tinggi dan rotasi jenis.
Larut dlm pelarut organik (petroleum eter, eter, kloroform, etanol) dan minyak lemak. Dapat dipisahkan dng destilasi uap; sedikit larut dalam air (Aqua aromatica, 1g minyak atsiri dalam 1000 ml air).
KOMPOSISI KIMIAWI
Komposisi kimiawi dari minyak atsiri sangat variatif, biasanya terdiri dari senyawa golongan terpena, senyawa aromatik turunan fenil propana, dan/ atau hasil degradasi terpena.
Kegunaan: Minyak atsiri berguna dlm pengobatan misalnya pada aromaterapi, dalam Spa (Sano par aquae), korigen odoris, saporis, dan flavoris.
Sebagai bumbu dapur (spices), sebagai parfum atau minyak wangi, serta kosmetika alami, serta pengharum berbagai produk kebersihan, pengharum ruangan, mobil, kloset, dsb.
FAKTOR KEANEKARAGAMAN MINYAK ATSIRI
Komponen yang terkandung dalam minyak atsiri tergantung dari faktor-faktor, a.l.:
Kondisi lingkungan hidup (iklim, musim, pemupukan, pengairan, tipe tanah, dsb).
Biologi (tipe kimia = chemotype), bibit, genetik, fenotip, umur).
Sumber daya manusia atau SDM (waktu pemanenan, teknologi pasca panen).
Cara penyekatan dan penyimpanan.
Lain-lain (nomenclatur atau tata nama).
MANFAAT MINYAK ATSIRI
Farmasi, m.a. digunakan sebagai aromaterapi, dapat tersedia dlm berbagai bentuk.
Parfumeri, sebagai pengharum dalam berbagai bentuk dan tergantung keperluan. Juga dalam kosmetika.
Teknologi makanan, sebagai bumbu (spices), pengawet, penyedap rasa (flavoring agent).
Prazat untuk sintesis. Misalnya eugenol menjadi vanilin.
PENYIMPANAN MINYAK ATSIRI YANG BAIK
Penyimpanan minyak atsiri yang tidak tepat akan mengubah kandungan kimia m.a., jadi m.a. harus disimpan dlm botol berwarna gelap (bahkan botol aluminium, stainless steel ), diisi hampir penuh (mencegah oksidasi), tertutup kedap (kalau mungkin diberi nitrogen sebagai gas inert), disimpan di tempat gelap, kering, dan sejuk. Mungkin juga perlu diberi antioksidan agar lebih awet (stabil), misalnya Vit. E.
Fotoisomerisasi, termoisomerisasi, fotosiklisasi, peruraian krn oksidasi, dan peroksida merupakan faktor yang merusak kandungan kimia minyak atsiri.
PASARAN MINYAK ATSIRI LOKAL DAN DUNIA
Minyak atsiri mrpk komoditi dagang dan ekspor yang penting di dunia perdagangan, karena sangat diminati oleh konsumen.
Pemerintah Indonesia mempunyai perangkat untuk mengawasi mutu barang ekspor, yaitu Balai Pemeriksaan Mutu Barang di Ciracas, Jakarta.
Dunia memerlukan clove oil (minyak cengkeh) sebanyak 1.200-1.400 metrik ton per tahun.
Kita pengekspor minyak kenanga, minyak cengkeh, minyak nilam, minyak cendana, minyak sereh, dan minyak pala.
METODE PRODUKSI
Cara memproduksi m.a. yang umum dilakukan adalah:
Destilasi uap air (steam distillation).
Pengepresan.
Ekstraksi dengan pelarut organik atau gas superkritik (karbon dioksida cair).
Steam distillation by microwaves under vacuum. Cara ini lebih cepat, sedikit enersi, hasil lebih banyak, suhu lebih rendah, bila dibandingkan dengan destilasi uap.
MINYAK ATSIRI DARI SUKU APIACEAE
Minyak atsiri yang berasal dari tanaman dlm fam. Umbelliferae a.l.:
* Oleum anisi, minyak adas manis
* Oleum foeniculi, minyak adas, minyak adas fenkel
* Minyak buah wortel
* Minyak buah ketumbar
* Minyak buah jinten
* Minyak buah jinten hitam
* Minyak buah seledri
Apium graveolens L
Apiaceae
(Seledri)
Daucus carota L.
Apiaceae
(fructus & flores)
APIOL & BERGAPTEN
OLEUM ANISI (Minyak adas manis)
Asal tanaman: Pimpinella anisum L. (Apiaceae)
Tempat tumbuh: Spanyol, Negara Balkan, Turki, dan Negara Afrika Utara.
Kandungan biji anisi a.l. polisakarida, lipid, flavonoid, glukosida asam p- hidroksi benzoat, dan minyak atsiri (20-30 ml/kg).
Komposisi m.a.: E-anethol (80-95%), metilkavikol (estragol), anisaldehida, asam 2-metil butirat, dan
asam anisat (hasil oksidasi).
Uji kualitatif dan kuantitatif:
Dlm KLT larutan DCM nampak anetol dan trigliserida.
Untuk tes mikrokimiawi dapat dilihat dlm pustaka.
Untuk kadar m.a. buah dengan alat destilasi Stahl MMI.
Spektrofotometri IR (sidik jari)
Tetapan fisika dan kimia
Efek farmakologi & kegunaan
Efek farmakologi. Memiliki efek estrogenik, karena mengandung estragol dan anetol (struktur mirip stilbena). Anetol juga bersifat spasmolitik, merangsang sekresi saluran napas (ekspektoran). Juga bersifat sbg galaktogoga, karminatif, gangguan cerna (epigastric bloating, impaired digestion, eructation, flatulence, painful of dyspepsia).
Kegunaan. Secara oral, inhalasi, obat gosok. Perlu diperhatikan kemungkinan alergi.
Di Perancis dapat diperoleh hanya dng resep dokter.
TANAMAN YG MENGANDUNG MINYAK ATSIRI DARI ASTERACEAE
Bunga kamil (Chamomile flowers)
Asal tanaman: Anthemis nobilis (Roman chamomile); Matricaria recutita (L.) Raushert. (German chamomile).
Kandungan: Minyak atsiri (3-15 ml/kg), kumarin (umbeliferon, herniarin), asam fenolat, seskuiterpen-lakton [matrisin, (-)--bisabolol sampai 50%], dan flavonoid (apigenin 7-glukosida 8% bobot kering, luteolin-glukosida, kuersetin-glikosida, isoramnetin). Warna biru m.a. krn adanya kamazulena (1-15%).
Efek farmakologi: Sbg anti-inflamasi, spasmolitik, antibakteri, antifungi, koleretik, antihipertensif, sedatif, anastetik ringan, luka, eksem, dan deodoran.
Sediaan: Sbg tingtur yang dapat digunakan scr luwes.
alkaloiiiiid
• ALKALOIDS
• The biosynthesis of alkaloids can not be accommodated in any one of main biosynthetic pathway but frequently involves a combination of product from two or more of these route. For example alkaloids are formed from amino acids, but other precursors e.g. terpenes or steroid are often built into the final alkaloid skeleton
• Alkaloid can be defined as a cyclic organic compound containing nitrogen in a negative oxidation state which is of limited distribution among living organism
• Occurrence in the plant kingdom
• Alkaloid are not found in all plant families. The relatively uncommon in bacteria, algae, fungi and lichens. They are uncounted in ferns and conifer.
• Among monocotyledons, the families Liliaceae and Amaryllidaceae are rich in alkaloids. Many orchids also contain alkaloids
• Most alkaloids occur in dicotyledons
• A lot of plants remain to be investigated
• The location in the plant
• Alkaloids occur in every part of plant, but usually one or more organs have a higher content than the others. For example: opium alkaloids are encountered specially in the latex vessel of the poppy, but tropane alkaloids in the leaf petiole of Datura sp
• The organ with the highest alkaloid content is not necessarily the place where the alkaloid are formed.
• Grafting experiment found that tropane alkaloids of Artropa belladona are formed in the root and transported to the leaf for storage
• The transport of alkaloids synthesized in the roots seems to take place in the mainly via the vessel because alkaloids have been found in the vessel
• Role in the plant
• Presence of alkaloids protect the plant from being eaten by grazing cattle
• Alkaloids contents some times increase when the plant were had mechanic injure (nicotine in tobacco)
• Alkaloids can also serve to protect the plant against attack by microorganisms and viruses (solanine in potatoes increases when the plant is attacked by microorganism)
• Kinds of alkaloids
(Alkaloids are classified according to the amino acids that provides both the nitrogen atom and the fundamental portion of the alkaloid skeleton)
• Alkaloids derived from Ornithine (Pyrrolidine and Tropane alkaloids)
• Alkaloids derived from Lysine (Piperidine, Quinolizidine, and Indolizidine alkaloids)
• Alkaloids derived from Tyrosine (Phenylethylamines, simple tetrahydroisoquinoline, modified benzyltetra-hydroxyquinoline, Phenethylesoquinoline, Amaralidaceae alkaloids
• Kinds of alkaloids
• Alkaloids derived from Nicotinic Acid (Pyridine Alkaloids)
• Alkaloids derived from tryptophan (simple indol, terpenoid indol, quinoline, pyrroloindole, ergot alkaloids)
• Alkaloids derived from anthranilic acid (quinazoline, quinoline and acridine alkaloids)
• Alkaloids derived from amination reactions (acetate-derived, phenylalanine, terpenoid alkaloids
• Alkaloids derived from Nicotinic Acid (Pyridine Alkaloids) - Tobacco
• The biosynthetic pathway of tobacco alkaloids starts at putrescine as a key intermediate in biosynthesis of the pyrrolidine ring (Hiraoka, 1988, Chung & Blume, 1989).
• Putrescine is derived from either ornithine or arginine by a decarboxylation catalyzed by ornithine decarboxylase (ODC) and arginine decarboxylase (ADC) respectively (Figure 6) (Berlin, 1981).
• However, Tiburcio & Galston (1986) and Tiburcio et al. (1987) stated that ADC plays a major role for the generation of putrescine going into alkaloid as a specific ‘suicide inhibitor’ of ADC effectively inhibits the biosynthesis of nicotine and nornicotine in tobacco callus, while the analogous inhibitor of ODC is less effective. Moreover, incorporation of 14C from uniformly labeled arginine into nicotine is much higher than from ornithine.
• Continued
• Putrescine is metabolized further into aromatic amides or pyrrolidine alkaloids depending on the external and internal conditions in which plants, organs or cells grow (Hiraoka, 1988).
• Putrescine N-methyltransferase (PMT) and N-methylputrescine oxidase (MPO), the enzymes which catalyze N-methylputrescine from putrescine and 4-methylaminobutanal from N-methylputrescine respectively, were purified and characterized by Mizusaki et al. (1971a, 1971b, 1972) and Davies et al. (1989).
• Furthermore, five genes encoding PMT in N. tabacum were cloned by Riechers & Timko (1999). The genes are expressed only in the roots while the steady-state level of all five PMT transcripts is transiently increased in roots following topping. The activity of the enzymes in the 4-methylaminobutanal formation i.e. ODC, PMT and MPO were reported by Mizusaki et al. (1973) to be high in tobacco root but low or not detectable in tobacco leaves.
• Continued
• The study of interrelationship among nicotine, nornicotine, anabasine and anatabine by Alworth & Rapaport (1965) suggested that precursor-product relationship among these alkaloids must be nicotine-anatabine or anabasine. In a study of the nornicotine biosynthetic pathway, labeled nicotine was fed to tobacco cell suspension cultures (Hao & Yeoman, 1996) and the root culture of N. alata (Botte et al., 1997) showing that nicotine is the precursor of nornicotine.
flavonoiiiiid
• FLAVONOID
• Biogenesis berasal dari kombinasi antara jalur shikimat dan jalur asetat-mevalonat.
• Merupakan senyawa fenol terbanyak ditemukan di alam.
• Merupakan zat warna merah, ungu, biru, dan sebagian zat warna kuning.
• Kerangka dasar terdiri atas 15 atom karbon yang membentuk susunan C6-C3-C6.
• Kerangka dasar karbon dg 15 atom C dg 2 cincin benzen (C6) terikat pd suatu rantai propana (C3) membentuk susunan C6-C3-C6
• Senyawa flavonoid terdiri dr beberapa jenis tergantung tingkat oksidasi dr rantai propana dr sistem 1,3 diarilpropana
• Flavon, Flavonol dan antosianidin adalah jenis yg banyak ditemukan dialam (sering diebut flavonoid utama).
• Senyawa flavonoid larut dalam air, dpt diekstraksi dg etanol 70 % & tetap dlm lapisan air setelah ekstrakmdikocok dg eter minyak bumi
• Warna mudah berubah biladitambah basa atau amonia krn merupakan senyawa fenol ( mudah dideteksi pd kromatogram atau dlm larutan)
• Mengandung sistem aromatik yg terkonyugasi shg menunjukkan pita serapan kuat pd daerah spektrum UV dan Spektrum tampak.
• Flavonoid pd tumbuhan terikat pd gula sbg glikosida & aglikon flavonoid
• Flavonoid terdapat dl tumbuhan sbg campuran, jarang dijumpai sbg flavonoid tunggal pd jaringan tmbhn.
• Sering terdapat campuran dr flavonoid yg berbeda kelas, mis antosianin berwarna yg terdapat dlm bunga hampr selalu disertai oleh flavon / flavonol tanwarna ( flavon mrp ko-pigmen penting yg diperlukan utk menyatakan warna antosianin scr penuh dlm jaringan tmbhn.
• Semua flavonoid menurut strukturnya merupakan turunan senyawa induk flavon yg terdapat berupa tepung putih pd tmbh Primula, dan semuanya mempunyai sejumla siat yg sama. Dikenal sekitar 10 kelas flavonoid
• Istilah flavonoid berasal dari kata flavon yang merupakan salah satu jenis flavonoid yang terbanyak dan lazim ditemukan (selain flavonol, antosianidin).
• Flavon mempunyai kerangka 2-fenilkroman.
• Berdasarkan tingkat oksidasinya, flavan adalah yang terendah dan digunakan sebagai induk tatanama flavon.
• Isoflavonoid dan neoflavonoid hanya ditemukan dalam beberapa jenis tumbuhan.
• Ragam isoflavonoid:
• Ragam neoflavonoid:
• BIOSINTESIS FLAVONOID
• Cincin A dr struktur flavonoid berasal dr jalur poliketida, yaitu kondensasi dr 3 unit asetat atau malonat, sedangkan cincin B dan 3 atom C dr rantai propanaberasal dr jalur fenilpropanoida (jalur shikimat)
• Kerangka dasar karbon dr flavonoid dihslkan dr kombinasi antara 2 jenis biosinteis utama untuk cincin aromatik yaitu jalur shikimat dan jalur asetat-malonat.
• Biosintesis flavonoid
• Ciri struktur flavonoid
• Gugus hidroksil hampir selalu ditemukan pada posisi 5 dan & 7 dari cincin A.
• Ciri struktur flavonoid
• Cincin B flavonoid seringkali mempunyai gugus gugus hidroksil atau alkoksil pada posisi 4’, atau 3’ & 4’.
• Adanya tiga gugus hidroksil atau alkoksil, atau tidak teroksigenasi sama sekali, atau teroksigenasi pada posisi 2’, sangat jarang ditemukan.
• Hal tersebut disebabkan biogenesis dari flavonoid.
• Glikosida senyawa flavonoid berikatan dengan gula pada gugus hidroksil yang ada.
• Reaksi flavon dan flavonol
• Flavon dan flavonol dengan asam mineral menghasilkan garam flavilium yang berwarna. Garam tersebut dengan basa menghasilkan kembali flavonoid semula.
• Gugus fungsi oksigen pada posisi 5, 7, 4’ dapat meningkatkan stabilitas ion flavilium.
• Reaksi flavon dan flavonol
• Reduksi gugus keton yang selanjutnya disertai diperlakukan dengan asam mineral, akan dihasilkan garam flavilium.
• Reaksi flavon dan flavonol
• Gugus metoksi pada posisi 5 bila dipanaskan dengan HI akan mengalami demetilasi, diikuti penataan ulang dan resiklisasi, yang disebut penataan ulang Wessley-Moser.
• Reaksi flavon dan flavonol
• Bila cincin B mengandung gugus fungsi oksigen pada posisi 2’, maka dapat terjadi penataan ulang Wessley-Moser.
Nama Terpen diberikan trhadap senyawa yg mempunyai perumusan molekul C10H6, secara etimologi berasal dari pohon terebinth (Pistacia terebinthus)
Tanaman conifer, eucalyptus, dan jeruk kaya terpen volatil, dg volatilitas yg mudah dikenal karena berbau harum dikenal dengan minyak essential (minyak atsiri)
Senyawa terpenoid kebanyakan bebas dalam jaringan tanaman, tdk terikat senyawa lain. Namun banyak juga yg terdapat sebagai glikosida, ester dari asam organik & beberapa terikat dg protein
Terpenoid : lipid yang sangat bervariasi struktur dan fungsinya,mulai dari hormon adrenal (kortison), volatile sex pheromones, vit A, D & E sampai ke karet alam
Terpenoid : dibangun oleh satuan C5 isoprena, digolongkan atas monoterpenoid, seskuiterpenoid, diterpenoid, triterpenoid, tetraterpenoid dan politerpenoid serta terpenoid asiklik
Monoterpenoid : Komponen yang terdapt pada tumbuhan tingkat tinggi dan alga : sebagai attractant dan komponen minyak atsiri
Seskuiterpenoid : pada tumbuhan dan klorofil berbagai bakteri sebagai minyak atsiri dan antibiotik jamur
Diterpenoid : paling penting isoprenoid asiklik fitol, terdapat pada berbagai gliserida eter lipid bakterial sebagai dihidrofitol (fitanol): komponen yang umum pada tumbuhan tingkat tinggi
Triterpenoid : diturunkan dari isoprenoid asiklik skualen
(C30H50), komponen utuh dari minyak ikan, minyak vegetable, jamur.
Pentasiklik triterpenoid : komponen tumbuhan tingkat tinggi
bertipe oleanan, ursan dan lupan serta komponen bakteri
berupa tipe hopan
Berbagai triterpenoid organisme merupakan prekursor langsung
hidrokarbon dalam fosil sedimen dan minyak bumi.
Pentasiklik triterpenoid dengan cincin-E bersisi enam, hanya
terdapat pada tumbuhan tingkat tinggi dan yang bersisi lima hanya terdapat pada bakteri (disebut bakteriohopanoid)
Secara umum biosintesis terpenoid terjadinya melalui 3 reaksi dasar :
1. Pembentukan isopren aktif berasal dari asam
asetat melalui asam mevalonat
2. Penggabungan ekor dan kepala 2 unit isopren
akan membentuk mono-, seskui-, di-, dan
poli-terpenoid
3. Penggabungan ekor dan ekor dari unit C15 atau
C20 menghasilkan triterpenoid dan steroid
Dua bentuk isopren aktif yaitu isopentenil pirofosfat (IPP) dan dimetilalil pirofosfat (DMAPP) harus ada dalam biosintesis terpen dalam organisme. IPP dan DMAPP berasal dari asam mevalonat
Mekanisme pembentukannya melalui jalur asam mevalonat :
As. Asetat teraktifasi oleh koenzim-A membentuk asetil koenzim-A, selanjutnya melakukan kondensasi menghasilkan asam asetoasetil koenzim-A
Asetoasetil koenzim-A mengalami kondensasi lg dg asetil koenzim-A menghasilkan senyawa mevalonil koenzim-A selanjutnya mengalami reduksi menjadi asam mevalonat
Reaksi selanjutnya adalah fosforilasi, eliminasi asam fosfat dan dekarboksilasi menghasilkan IPP yg berisomerisasi menjadi DMAPP oleh enzim isomerase
IPP dan DMAPP sbg unit isopren aktif berkondensasi melalui interaksi kepala ke ekor yang merupakan polimerisasi isopren untuk menghasilkan terpenoid
Biogenetik terpenoid berasal dari isopentenyl-pyrophosphate (IPP) terdiri dari lima atom karbon sebagai batu bata (building block) via jalur asam mevalonat (MVA). Isomer IPP adalah DMAPP (dimethyl allyl pyrophosphate). Kedua molekul tsb bergabung menjadi geranyl-pyrophosphate (GPP), farnesylpyrophosphate (FPP), dan geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP).
Selanjutnya berturut-turut menjadi monoterpena (10 C), seskuiterpena (15 C), dan diterpena (20 C).
SKEMA BIOSINTESIS TERPENOID
FPP SESKUITERPENA
2x
IPP DMAPP Sitosol/ER
===========================
IPP DMAPP Plastida
3x 1x
GPP MONOTERPENA
GGPP DITERPENA
MONOTERPENA
Monoterpena reguler: Berasal dari GPP yang kemudian termodifikasi, mrpk komponen minyak atsiri, dpt berbentuk monosiklik (karvon, kamfor, limonena, dsb); bisiklik (pinena, kamfena, sabi-nena, tuyon, dsb).
Monoterpena ireguler: Berasal dari kondensasi dua DMAPP menjadi krisan-temil PP, terdapat dlm fam. Asteraceae (Artemisia dan Chrysanthemum).
TUMBUHAN YANG MENGANDUNG MONOTERPENA
Simplisia yang mengandung monoterpena reguler biasanya terkandung sebagai komponen minyak atsiri, bersama dengan seskuiterpena, sedangkan monoterpena ireguler terdapat dalam tanaman Chrysanthemum cinerariaefolium, Artemisia cina, Artemisia annua.
Iridoid sebagai glikosida terdapat dalam tumbuhan Heydiotis corymbosa L., Plantago mayor L., Valeriana officinalis L.
Artemisia vulgaris L.
Asteraceae
(Sudamala)
Artemisia cina O. Berg
Asteraceae
SESKUITERPENA
Berasal dari farnesilpirofosfat (FPP), mrpk hasil reaksi adisi IPP dan GPP. Sering dalam bentuk bisiklik, misalnya membentuk germakrena dan mengandung gugus lakton dengan berbagai bioaktivitas.
Tdp sbg komponen minyak atsiri bersama monoterpena.
Selain itu, juga tdp dlm biji Gossypium spp. sbg gosipol (0,3-2%). Pd hewan coba menunjukkan oligospermia (utk KB pria).
MINYAK ATSIRI
Nama sinonim: Minyak penguap, volatile oils, essentiale oils.
Definisi:
Minyak atsiri adalah produk, yang kompleks komponennya, yang berasal dari tumbuhan tertentu.
Penyarian: Dpt menggunakan berbagai cara, misalnya distilasi uap, distilasi uap-air, pengepresan, penyarian dng pelarut organik (solvent)
JENIS EKSTRAK MINYAK ATSIRI
CONCRETE . Ekstrak dengan bau khas didapat bahan segar tumbuhan dengan penyari bukan air.
POMADE. Lemak berparfum didapat dari bunga segar dengan “cold enfleurage” atau “hot enfleurage”.
RESINOID. Ekstrak berbau khas, didapat dari bahan kering yang disari dng penyari nir air. Bahan dasar dapat tumbuhan, hewan, mikrobia, juga hasil fermentasi.
ABSOLUTE . Produk dengan bau khas didapat dari ketiga produk di atas, diekstraksi dng etanol pada suhu tertentu. Hasil penyarian didinginkan, disaring untuk menyingkirkan lilin/lemak, kemudian etanol diuapkan.
DISTRIBUSI (PENYEBARAN)
Minyak atsiri tersebar dlm tumbuhan tinggi sekitar 17.500 jenis. Beberapa marga dari familia a.l. Myrtaceaea, Lauraceae, Rutaceae, Lamiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Cupressaceae, Poaceae, Zingiberaceae, dan Piperaceae.
Minyak atsiri terkumpul pada :
- bunga (bergamot, kenanga, melati, mawar),
- daun (kayuputih, eukaliptus, sereh, pandan
wangi, minyak daun cengkeh)
- buah (anisi, foeniculi, staranise),
- kulit kayu (kayu manis jangan, mesoyi),
- akar (akar wangi),
- kayu (cendana, gaharu), rimpang (jahe, -
temulawak, kunyit), dan biji (pala).
Rosa centifolia L.
Asteraceae
(Mawar)
AKUMULASI MINYAK ATSIRI
Minyak atsiri terkumpul dalam organ tanaman tertentu, misalnya:
dalam sel minyak (Lauraceae dan Zingberaceae),
rambut kelenjar (Lamiaceae=Labiatae),
ruang sekrit (Rutaceae dan Myrtaceae),
saluran sekrit (Apiaceae dan Asteraceae).
FUNGSI
Secara biologi fungsi minyak atsiri bagi tumbuhan belum jelas benar, namun kemungkinan berperan dlm segi ekologi. Misalnya dalam alelopati, minyak atsiri dapat menghambat pertumbuhan tumbuhan di sekelilingnya; menghambat perkecambahan; pelindung terhadap predator, dan penarik hewan (insekta, burung, kelelawar) untuk penyerbukan.
SIFAT FISIKA
Minyak atsiri pada suhu kamar cairan yang mudah menguap, berbeda dengan minyak lemak (fixed oils); biasanya sedikit larut dalam air. Bobot jenis biasanya lebih rendah dari pada air (kecuali Ol. Cinnamomi). Mempunyai indeks bias tinggi dan rotasi jenis.
Larut dlm pelarut organik (petroleum eter, eter, kloroform, etanol) dan minyak lemak. Dapat dipisahkan dng destilasi uap; sedikit larut dalam air (Aqua aromatica, 1g minyak atsiri dalam 1000 ml air).
KOMPOSISI KIMIAWI
Komposisi kimiawi dari minyak atsiri sangat variatif, biasanya terdiri dari senyawa golongan terpena, senyawa aromatik turunan fenil propana, dan/ atau hasil degradasi terpena.
Kegunaan: Minyak atsiri berguna dlm pengobatan misalnya pada aromaterapi, dalam Spa (Sano par aquae), korigen odoris, saporis, dan flavoris.
Sebagai bumbu dapur (spices), sebagai parfum atau minyak wangi, serta kosmetika alami, serta pengharum berbagai produk kebersihan, pengharum ruangan, mobil, kloset, dsb.
FAKTOR KEANEKARAGAMAN MINYAK ATSIRI
Komponen yang terkandung dalam minyak atsiri tergantung dari faktor-faktor, a.l.:
Kondisi lingkungan hidup (iklim, musim, pemupukan, pengairan, tipe tanah, dsb).
Biologi (tipe kimia = chemotype), bibit, genetik, fenotip, umur).
Sumber daya manusia atau SDM (waktu pemanenan, teknologi pasca panen).
Cara penyekatan dan penyimpanan.
Lain-lain (nomenclatur atau tata nama).
MANFAAT MINYAK ATSIRI
Farmasi, m.a. digunakan sebagai aromaterapi, dapat tersedia dlm berbagai bentuk.
Parfumeri, sebagai pengharum dalam berbagai bentuk dan tergantung keperluan. Juga dalam kosmetika.
Teknologi makanan, sebagai bumbu (spices), pengawet, penyedap rasa (flavoring agent).
Prazat untuk sintesis. Misalnya eugenol menjadi vanilin.
PENYIMPANAN MINYAK ATSIRI YANG BAIK
Penyimpanan minyak atsiri yang tidak tepat akan mengubah kandungan kimia m.a., jadi m.a. harus disimpan dlm botol berwarna gelap (bahkan botol aluminium, stainless steel ), diisi hampir penuh (mencegah oksidasi), tertutup kedap (kalau mungkin diberi nitrogen sebagai gas inert), disimpan di tempat gelap, kering, dan sejuk. Mungkin juga perlu diberi antioksidan agar lebih awet (stabil), misalnya Vit. E.
Fotoisomerisasi, termoisomerisasi, fotosiklisasi, peruraian krn oksidasi, dan peroksida merupakan faktor yang merusak kandungan kimia minyak atsiri.
PASARAN MINYAK ATSIRI LOKAL DAN DUNIA
Minyak atsiri mrpk komoditi dagang dan ekspor yang penting di dunia perdagangan, karena sangat diminati oleh konsumen.
Pemerintah Indonesia mempunyai perangkat untuk mengawasi mutu barang ekspor, yaitu Balai Pemeriksaan Mutu Barang di Ciracas, Jakarta.
Dunia memerlukan clove oil (minyak cengkeh) sebanyak 1.200-1.400 metrik ton per tahun.
Kita pengekspor minyak kenanga, minyak cengkeh, minyak nilam, minyak cendana, minyak sereh, dan minyak pala.
METODE PRODUKSI
Cara memproduksi m.a. yang umum dilakukan adalah:
Destilasi uap air (steam distillation).
Pengepresan.
Ekstraksi dengan pelarut organik atau gas superkritik (karbon dioksida cair).
Steam distillation by microwaves under vacuum. Cara ini lebih cepat, sedikit enersi, hasil lebih banyak, suhu lebih rendah, bila dibandingkan dengan destilasi uap.
MINYAK ATSIRI DARI SUKU APIACEAE
Minyak atsiri yang berasal dari tanaman dlm fam. Umbelliferae a.l.:
* Oleum anisi, minyak adas manis
* Oleum foeniculi, minyak adas, minyak adas fenkel
* Minyak buah wortel
* Minyak buah ketumbar
* Minyak buah jinten
* Minyak buah jinten hitam
* Minyak buah seledri
Apium graveolens L
Apiaceae
(Seledri)
Daucus carota L.
Apiaceae
(fructus & flores)
APIOL & BERGAPTEN
OLEUM ANISI (Minyak adas manis)
Asal tanaman: Pimpinella anisum L. (Apiaceae)
Tempat tumbuh: Spanyol, Negara Balkan, Turki, dan Negara Afrika Utara.
Kandungan biji anisi a.l. polisakarida, lipid, flavonoid, glukosida asam p- hidroksi benzoat, dan minyak atsiri (20-30 ml/kg).
Komposisi m.a.: E-anethol (80-95%), metilkavikol (estragol), anisaldehida, asam 2-metil butirat, dan
asam anisat (hasil oksidasi).
Uji kualitatif dan kuantitatif:
Dlm KLT larutan DCM nampak anetol dan trigliserida.
Untuk tes mikrokimiawi dapat dilihat dlm pustaka.
Untuk kadar m.a. buah dengan alat destilasi Stahl MMI.
Spektrofotometri IR (sidik jari)
Tetapan fisika dan kimia
Efek farmakologi & kegunaan
Efek farmakologi. Memiliki efek estrogenik, karena mengandung estragol dan anetol (struktur mirip stilbena). Anetol juga bersifat spasmolitik, merangsang sekresi saluran napas (ekspektoran). Juga bersifat sbg galaktogoga, karminatif, gangguan cerna (epigastric bloating, impaired digestion, eructation, flatulence, painful of dyspepsia).
Kegunaan. Secara oral, inhalasi, obat gosok. Perlu diperhatikan kemungkinan alergi.
Di Perancis dapat diperoleh hanya dng resep dokter.
TANAMAN YG MENGANDUNG MINYAK ATSIRI DARI ASTERACEAE
Bunga kamil (Chamomile flowers)
Asal tanaman: Anthemis nobilis (Roman chamomile); Matricaria recutita (L.) Raushert. (German chamomile).
Kandungan: Minyak atsiri (3-15 ml/kg), kumarin (umbeliferon, herniarin), asam fenolat, seskuiterpen-lakton [matrisin, (-)--bisabolol sampai 50%], dan flavonoid (apigenin 7-glukosida 8% bobot kering, luteolin-glukosida, kuersetin-glikosida, isoramnetin). Warna biru m.a. krn adanya kamazulena (1-15%).
Efek farmakologi: Sbg anti-inflamasi, spasmolitik, antibakteri, antifungi, koleretik, antihipertensif, sedatif, anastetik ringan, luka, eksem, dan deodoran.
Sediaan: Sbg tingtur yang dapat digunakan scr luwes.
alkaloiiiiid
• ALKALOIDS
• The biosynthesis of alkaloids can not be accommodated in any one of main biosynthetic pathway but frequently involves a combination of product from two or more of these route. For example alkaloids are formed from amino acids, but other precursors e.g. terpenes or steroid are often built into the final alkaloid skeleton
• Alkaloid can be defined as a cyclic organic compound containing nitrogen in a negative oxidation state which is of limited distribution among living organism
• Occurrence in the plant kingdom
• Alkaloid are not found in all plant families. The relatively uncommon in bacteria, algae, fungi and lichens. They are uncounted in ferns and conifer.
• Among monocotyledons, the families Liliaceae and Amaryllidaceae are rich in alkaloids. Many orchids also contain alkaloids
• Most alkaloids occur in dicotyledons
• A lot of plants remain to be investigated
• The location in the plant
• Alkaloids occur in every part of plant, but usually one or more organs have a higher content than the others. For example: opium alkaloids are encountered specially in the latex vessel of the poppy, but tropane alkaloids in the leaf petiole of Datura sp
• The organ with the highest alkaloid content is not necessarily the place where the alkaloid are formed.
• Grafting experiment found that tropane alkaloids of Artropa belladona are formed in the root and transported to the leaf for storage
• The transport of alkaloids synthesized in the roots seems to take place in the mainly via the vessel because alkaloids have been found in the vessel
• Role in the plant
• Presence of alkaloids protect the plant from being eaten by grazing cattle
• Alkaloids contents some times increase when the plant were had mechanic injure (nicotine in tobacco)
• Alkaloids can also serve to protect the plant against attack by microorganisms and viruses (solanine in potatoes increases when the plant is attacked by microorganism)
• Kinds of alkaloids
(Alkaloids are classified according to the amino acids that provides both the nitrogen atom and the fundamental portion of the alkaloid skeleton)
• Alkaloids derived from Ornithine (Pyrrolidine and Tropane alkaloids)
• Alkaloids derived from Lysine (Piperidine, Quinolizidine, and Indolizidine alkaloids)
• Alkaloids derived from Tyrosine (Phenylethylamines, simple tetrahydroisoquinoline, modified benzyltetra-hydroxyquinoline, Phenethylesoquinoline, Amaralidaceae alkaloids
• Kinds of alkaloids
• Alkaloids derived from Nicotinic Acid (Pyridine Alkaloids)
• Alkaloids derived from tryptophan (simple indol, terpenoid indol, quinoline, pyrroloindole, ergot alkaloids)
• Alkaloids derived from anthranilic acid (quinazoline, quinoline and acridine alkaloids)
• Alkaloids derived from amination reactions (acetate-derived, phenylalanine, terpenoid alkaloids
• Alkaloids derived from Nicotinic Acid (Pyridine Alkaloids) - Tobacco
• The biosynthetic pathway of tobacco alkaloids starts at putrescine as a key intermediate in biosynthesis of the pyrrolidine ring (Hiraoka, 1988, Chung & Blume, 1989).
• Putrescine is derived from either ornithine or arginine by a decarboxylation catalyzed by ornithine decarboxylase (ODC) and arginine decarboxylase (ADC) respectively (Figure 6) (Berlin, 1981).
• However, Tiburcio & Galston (1986) and Tiburcio et al. (1987) stated that ADC plays a major role for the generation of putrescine going into alkaloid as a specific ‘suicide inhibitor’ of ADC effectively inhibits the biosynthesis of nicotine and nornicotine in tobacco callus, while the analogous inhibitor of ODC is less effective. Moreover, incorporation of 14C from uniformly labeled arginine into nicotine is much higher than from ornithine.
• Continued
• Putrescine is metabolized further into aromatic amides or pyrrolidine alkaloids depending on the external and internal conditions in which plants, organs or cells grow (Hiraoka, 1988).
• Putrescine N-methyltransferase (PMT) and N-methylputrescine oxidase (MPO), the enzymes which catalyze N-methylputrescine from putrescine and 4-methylaminobutanal from N-methylputrescine respectively, were purified and characterized by Mizusaki et al. (1971a, 1971b, 1972) and Davies et al. (1989).
• Furthermore, five genes encoding PMT in N. tabacum were cloned by Riechers & Timko (1999). The genes are expressed only in the roots while the steady-state level of all five PMT transcripts is transiently increased in roots following topping. The activity of the enzymes in the 4-methylaminobutanal formation i.e. ODC, PMT and MPO were reported by Mizusaki et al. (1973) to be high in tobacco root but low or not detectable in tobacco leaves.
• Continued
• The study of interrelationship among nicotine, nornicotine, anabasine and anatabine by Alworth & Rapaport (1965) suggested that precursor-product relationship among these alkaloids must be nicotine-anatabine or anabasine. In a study of the nornicotine biosynthetic pathway, labeled nicotine was fed to tobacco cell suspension cultures (Hao & Yeoman, 1996) and the root culture of N. alata (Botte et al., 1997) showing that nicotine is the precursor of nornicotine.
flavonoiiiiid
• FLAVONOID
• Biogenesis berasal dari kombinasi antara jalur shikimat dan jalur asetat-mevalonat.
• Merupakan senyawa fenol terbanyak ditemukan di alam.
• Merupakan zat warna merah, ungu, biru, dan sebagian zat warna kuning.
• Kerangka dasar terdiri atas 15 atom karbon yang membentuk susunan C6-C3-C6.
• Kerangka dasar karbon dg 15 atom C dg 2 cincin benzen (C6) terikat pd suatu rantai propana (C3) membentuk susunan C6-C3-C6
• Senyawa flavonoid terdiri dr beberapa jenis tergantung tingkat oksidasi dr rantai propana dr sistem 1,3 diarilpropana
• Flavon, Flavonol dan antosianidin adalah jenis yg banyak ditemukan dialam (sering diebut flavonoid utama).
• Senyawa flavonoid larut dalam air, dpt diekstraksi dg etanol 70 % & tetap dlm lapisan air setelah ekstrakmdikocok dg eter minyak bumi
• Warna mudah berubah biladitambah basa atau amonia krn merupakan senyawa fenol ( mudah dideteksi pd kromatogram atau dlm larutan)
• Mengandung sistem aromatik yg terkonyugasi shg menunjukkan pita serapan kuat pd daerah spektrum UV dan Spektrum tampak.
• Flavonoid pd tumbuhan terikat pd gula sbg glikosida & aglikon flavonoid
• Flavonoid terdapat dl tumbuhan sbg campuran, jarang dijumpai sbg flavonoid tunggal pd jaringan tmbhn.
• Sering terdapat campuran dr flavonoid yg berbeda kelas, mis antosianin berwarna yg terdapat dlm bunga hampr selalu disertai oleh flavon / flavonol tanwarna ( flavon mrp ko-pigmen penting yg diperlukan utk menyatakan warna antosianin scr penuh dlm jaringan tmbhn.
• Semua flavonoid menurut strukturnya merupakan turunan senyawa induk flavon yg terdapat berupa tepung putih pd tmbh Primula, dan semuanya mempunyai sejumla siat yg sama. Dikenal sekitar 10 kelas flavonoid
• Istilah flavonoid berasal dari kata flavon yang merupakan salah satu jenis flavonoid yang terbanyak dan lazim ditemukan (selain flavonol, antosianidin).
• Flavon mempunyai kerangka 2-fenilkroman.
• Berdasarkan tingkat oksidasinya, flavan adalah yang terendah dan digunakan sebagai induk tatanama flavon.
• Isoflavonoid dan neoflavonoid hanya ditemukan dalam beberapa jenis tumbuhan.
• Ragam isoflavonoid:
• Ragam neoflavonoid:
• BIOSINTESIS FLAVONOID
• Cincin A dr struktur flavonoid berasal dr jalur poliketida, yaitu kondensasi dr 3 unit asetat atau malonat, sedangkan cincin B dan 3 atom C dr rantai propanaberasal dr jalur fenilpropanoida (jalur shikimat)
• Kerangka dasar karbon dr flavonoid dihslkan dr kombinasi antara 2 jenis biosinteis utama untuk cincin aromatik yaitu jalur shikimat dan jalur asetat-malonat.
• Biosintesis flavonoid
• Ciri struktur flavonoid
• Gugus hidroksil hampir selalu ditemukan pada posisi 5 dan & 7 dari cincin A.
• Ciri struktur flavonoid
• Cincin B flavonoid seringkali mempunyai gugus gugus hidroksil atau alkoksil pada posisi 4’, atau 3’ & 4’.
• Adanya tiga gugus hidroksil atau alkoksil, atau tidak teroksigenasi sama sekali, atau teroksigenasi pada posisi 2’, sangat jarang ditemukan.
• Hal tersebut disebabkan biogenesis dari flavonoid.
• Glikosida senyawa flavonoid berikatan dengan gula pada gugus hidroksil yang ada.
• Reaksi flavon dan flavonol
• Flavon dan flavonol dengan asam mineral menghasilkan garam flavilium yang berwarna. Garam tersebut dengan basa menghasilkan kembali flavonoid semula.
• Gugus fungsi oksigen pada posisi 5, 7, 4’ dapat meningkatkan stabilitas ion flavilium.
• Reaksi flavon dan flavonol
• Reduksi gugus keton yang selanjutnya disertai diperlakukan dengan asam mineral, akan dihasilkan garam flavilium.
• Reaksi flavon dan flavonol
• Gugus metoksi pada posisi 5 bila dipanaskan dengan HI akan mengalami demetilasi, diikuti penataan ulang dan resiklisasi, yang disebut penataan ulang Wessley-Moser.
• Reaksi flavon dan flavonol
• Bila cincin B mengandung gugus fungsi oksigen pada posisi 2’, maka dapat terjadi penataan ulang Wessley-Moser.
Selasa, 04 Oktober 2011
metsek
SENYAWA ORGANIK BAHAN ALAM
Dra. Evi Mintowati Kuntoini, M.Si.
Karakteristik Senyawa OBA
Metabolit Primer
Tersebar merata dalam tiap organisme
Fungsi universal, sumber energi, enzim, pengemban keturunan bahan struktur
Perbedaan struktur kimia kecil
Keaktifan fisiologis berkaitan dengan struktur kimia
Metabolit Sekunder
Tidak merata
Fungsi ekologis adl penarik serangga, pelindung diri, alat bersaing, hormon
Struktur kimia berbeda-beda
Keaktifan fisiologis berkaitan dengan struktur kimia
METABOLIT SEKUNDER (SENYAWA OBA)
Menurut Herbert (1995), metabolit sekunder mempunyai kriteria sebagai berikut :
Penyebarannya lebih terbatas.
Terdapat pada tanaman dan mikroorganisme tertentu serta mempunyai karakteristik untuk setiap genera, spesies atau suatu strain tertentu.
Metabolit tersebut dibentuk melalui jalur yang khusus dari metabolit primer.
Fungsi senyawa metabolit sekunder secara umum yaitu.
Pertahanan diri dari serangan herbivora : insekta, moluska dan vertebrata.
Pertahanan diri terhadap mikroorganisme : bakteri, fungi dan virus.
Berfungsi sebagai proteksi terhadap sinar ultra violet, atraktan terhadap polinator dan untuk proses penyebaran biji.
Biosintesis senyawa bioaktif atau metabolit sekunder sangat beragam tergantung golongan senyawa yang bersangkutan.
Prazat atau senyawa awal pembentuk metabolit sekunder berasal dari metabolisme primer
Pada gambar ditunjukkan bagaimana metabolit (prazat) terbentuk dari proses dasar yaitu fotosintesis, glikolisis, daur krebs yang menghasilkan energi pada metabolisme antara. Sejumlah prazat diperlukan, namun jenisnya terbatas, sehingga metabolisme dapat berlangsung dari hanya beberapa prazat yang terbatas.
prazat yang sangat penting digunakan dalam biosintesis metabolit sekunder diturunkan dari zantara asetil koenzim A (acetyl-CoA), asam sikimat, asam mevalonat. Zantara ini diperlukan secara berturutan dalam jalur asetat, sikimat dan mevalonat, yang merupakan dasar biosintesis metabolit sekunder (Dewick, 2002).
1. SENYAWA ISOPRENOID (JALUR MEVALONAT)
Berbagai produk tumbuhan yg memiliki beberapa sifat umum lipid membentuk beraneka golongan senyawa, golongan ini dinamakan isoprenoid, terpenoid atau terpen (untuk isoprenoid tanpa oksigen & merupakan hidrokarbon murni).
Yang termasuk isoprenoid antara lain adalah : hormon seperti giberelin dan asam absisat, farnesol (sebagai pengatur stomata pada gandum), xantoksin (prazat hormon asam absisat), sterol, karotenoid, turpentin,
Banyak isoprenoid bersifat mempengaruhi tumbuhan lain atau hewan sehingga menguntungkan tumbuhan yg mengandungnya.
Senyawa kimia (tidak termasuk makanan) yg mempengaruhi spesies lain disebut ZAT ALELOKIMIA.
ALELOPATI adalah keadaan khusus alelokimia yang melibatkan interaksi kimiawi negatif antara spesies tumbuhan yang berbeda
STEROL
Semua sterol (alkohol steroid) adalah triterpenoid. Sterol yg paling banyak di ganggang hijau dan tumbuhan tingkat tinggi adalah sitosterol, stigmasterol, kampesterol, kolesterol, ergosterol (umumnya di fungi yg diubah oleh radiasi UV matahari menjadi vit. D) dan anteridiol (senyawa penarik sexual yg dikeluarkan oleh galur betina fungi air Achlya bisexual).
Sterol terdapat di semua membran dari semua organisme kecuali bakteri, yg memiliki fungsi utama dalam stabilitas membran, selain itu juga memilki aktivitas alelokimia.
KAROTENOID
Karotenoid adalah kelompok isoprenoid yg berhubungan fungsinya dalam fotosintesis. Karotenoid adalah pigmen berwarna kuning, jingga atau merah yang terdapat di berbagai macam plastid berwarna (kromoplas) di akar, batang, daun, bunga dan buah berbagai tumbuhan.
β-karoten merupakan karotenoid yg paling banyak dijumpai pada tumbuhan tingkat tinggi dan menyebabkan akar wortel berwarna jingga. Likopen merupakan jenis karoten yg memberi warna merah pada buah tomat. Lutein merupakan suatu xantofil yg terdapat banyak di daun.
Fungsi karotenoid di daun yaitu karotenoid di kloroplas berperan dalam fotosintesis, dan karoten lainnya mencegah fotooksidasi klorofil.
β-karoten bertindak sebagai antioksidan melindungi dari kanker
ANEKA ISOPRENOID DAN MINYAK ESENSIAL
Unit isoprenoid yg dipadatkan menjadi senyawa cincin yg umumnya mengandung jumlah atom karbon 10 (monoterpenoid), 15 (sesquiterpenoid), 20 (diterpenoid) atau 30 (triterpenoid).
Minyak esensial adalah terpenoid yg mengandung 10 atau 15 karbon, bersifat mudah menguap (bersifat atsiri) dan menyebabkan aroma (bau) pada spesies terntentu, antara lain 71 senyawa atsiri di kulit jeruk merupakan sebagian besar monoterpenoid, terutama limonen.
Nama sinonim: Minyak penguap, volatile oils, essentiale oils.
Definisi: Minyak atsiri adalah produk yang kompleks komponennya, yang berasal dari tumbuhan tertentu.
Salah satu minyak esensial adalah turpentin yg terdapat di sel khusus genus Pinus. Senyawa ini dan sejenisnya misalnya mirsen dan limonen merupakan terpenoid paling beracun bagi kumbang kayu yg mematikan pohon. Pada Pinus senyawa limonen merupakan penolak serangga.
Turunan terpenoid lainya yi glaukolida A yg sebagian besar hanya dijumpai pd Asteraceae, rasanya pahit sehingga mengganggu berbagai serangga dan mamalia pengunyah
Resin yg umum terdapat pada pohon konifer dan beberapa Angiospermae tropis bersifat melindungi pohon terhadap berbagai macam serangga.
DISTRIBUSI MINYAK ATSIRI
Minyak atsiri tersebar dlm tumbuhan tinggi sekitar 17.500 jenis. Beberapa marga a.l. Myrtaceaea, Lauraceae, Rutaceae, Lamiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Cupressaceae, Poaceae, Zingibera-ceae, dan Piperaceae.
Minyak atsiri terkumpul pada bunga (bergamot, kenanga, melati, mawar), daun (kayuputih, eukaliptus, sereh, pandan wangi, minyak daun cengkeh), buah (anisi, foeniculi, staranise), kulit kayu (kayu manis jangan, mesoyi), akar (akar wangi), kayu (cendana, gaharu), rimpang (jahe, temulawak, kunyit), dan biji (pala).
AKUMULASI MINYAK ATSIRI
Minyak atsiri terkumpul dalam organ tanaman tertentu, misalnya: dalam sel minyak (Lauraceae dan Zingberaceae), rambut kelenjar (Lamiaceae=Labiatae), ruang sekrit (Rutaceae dan Myrtaceae), saluran sekrit (Apiaceae dan Asteraceae).
FUNGSI
Secara biologi fungsi minyak atsiri bagi tumbuhan belum jelas benar, namun kemungkinan berperan dlm segi ekologi. Misalnya dalam alelopati, minyak atsiri dapat menghambat pertumbuhan tumbuhan di sekelilingnya; menghambat perkecambahan; pelindung terhadap predator, dan penarik hewan (insekta, burung, kelelawar) untuk penyerbukan
MANFAAT MINYAK ATSIRI
Farmasi, m.a. digunakan sebagai aromaterapi, dapat tersedia dlm berbagai bentuk.
Parfumeri, sebagai pengharum dalam berbagai bentuk dan tergantung keperluan. Juga dalam kosmetika.
Teknologi makanan, sebagai bumbu (spices), pengawet, penyedap rasa (flavoring agent).
Prazat untuk sintesis. Misalnya eugenol menjadi vanilin.
2. SENYAWA FENOL (JALUR SIKIMAT)
Senyawa yg termasuk fenol antara lain : asam sinamat, p-kumarat, kafeat, ferulat, klorogenat, galat dan protokatekuat.
Asam protokatekuat dan klorogenat mempunyai fungsi khusus dalam resistensi penyakit pada tumbuhan tertentu. Asam protokatekuat merupakan salah satu senyawa yg mencegah corengan pada varietas bawang berwarna tertentu yg disebabkan oleh fungi Colletotrichum circinans.
Pada tanama kultivar tertentu yg tahan penyakit, asam klorogenat dan senyawa yg serupa tertentu segera terbentuk dan teroksidasi menjadi quinon yg bersifat fungistatis kuat. Sehingga infeksi terlokalisasi dg baik pada tumbuhan yang resisten.
Asam ferulat berperan dalam perlindungan tumbuhan dengan membentuk bagian dari fraksi fenol pada suberin.
Asam galat yang dirubah menjadi galotanin merupakan senyawa yg sangat menghambat pertumbuhan tanaman. Galotanin bertindak sebagai senyawa alelopati, menghambat pertumbuhan spesies lain yg tumbuh di sekitar tumbuhan yg mengandung dan melepaskannya.
FITOALEKSIN, ELISITOR DAN PERLINDUNGAN PENYAKIT TANAMAN
Kelompok senyawa antimikroba yang disintesis tumbuhan bila terinfeksi oleh mikroba disebut sebagai fitoaleksin. Pada umumnnya fitoaleksin jauh lebih beracun terhadap fungi daripada bakteri.
Senyawa yg bertindak sebagai fitoaleksin antara lain :
Gliseoin di akar kedelai, pisatin di polong kapri, faseolin di polong buncis, lipomeamaron di akar umbi jalar, arkinol di umbi anggrek.
Sebagian besar fitoaleksin adalah fenilpropanoid fenol, beberapa senyawa merupakan isoprenoid dan poliasetilen.
Beraneka macam senyawa, bahkan virus, dapat meningkatkan produksi fitoaleksin.
Senyawa yang menyebabkan diproduksinya fitoaleksin disebut elisitor, walaupun elisitor jg mendorong tumbuhan untuk mengaktifkan reaksi pertahanan lainnya.
Beberapa elisitor merupakan polisakarida yg dihasilkan bila fungi atau bakteri patogenik menyerang dinding sel tumbuhan, sedangkan elisitor lainnya adalah polisakarida yg dihasilkan dari perombakan dinding sel fungi oleh enzim tumbuhan yg dikeluarkan oleh tumbuhan karena fungi.
3. ALKALOID (JALUR SIKIMAT)
Tumbuhan yg menggandung senyawa nitrogen aromatik dikenal dg alkaloid (berasal dr turunan as. Amino tertentu a.l. fenilalanin, tirosin, triptofan, lisin, ornitin dll)
Alkaloid menarik krn aktivitas fisiologis dan psikologisnya yg dramatis pd manusia dan hewan lain serta karena dipercaya bahwa banyak di antaranya yg juga mempunyai peranan penting dalam tumbuhan (a.l. melindungi tumbuhan).
Lebih dr 3000 alkaloid telah ditemukan dlm 4000 spesies tumbuhan, paling sering pada dikotil herba. Hanya beberapa monokotil dan Gimnospermae yg mengandung alkaloid
Alkoloid pertama yg diisolasi dan dikristalkan adalah obat bius morfin, diisolasi pd th 1805 dr Papaver somniverum
Alkaloid yang terkandung dalam opium, yaitu dengan mendaras getah yang diambil dari buah yang tua tetapi belum masak dari tanaman Papaver somniferum L. (suku Papaveraceae)
4. FLAVONOID (JALUR SIKIMAT)
Terdapat 3 kelompok flavonoid yg menarik dalam fisiologi tumbuhan yaitu : antosianin, flavonol dan flavon
Sebagian besar flavonoid terhimpun di vakuola tengah, meskipun disintesis di luar vakuola
Antosianin
Merupakan pigmen berwarna yg umumnya pd bunga merah, ungu dan biru. Tp terdapat jg pada bagian tumbuhan lain mis. buah, batang, daun dan akar. Antosianin umumnya tdk terdapat pd lumut hati, ganggang dan tumbuhan rendah lainya.
Fungsi antosianin a.l. utk membantu penyerbukan pd bunga dg menarik perhatian lebah dan burung yg membawa serbuk sari
Flavonol dan flavon
Berhubungan dekat dg antosianin tp berbeda dlm struktur cincin tengah yg mengandung oksigen
Sebagian besar flavon dan flavonol merupakan pigmen berwarna kekuningan atau gading pada bunga
Molekul flavon & flavonol jg tersebar di daun, berperan sebagai pencegah pemakan daun krn menyerap radiasi UV, berperan sebagai pelindung terhadap cahaya UV gelombang panjang
Dra. Evi Mintowati Kuntoini, M.Si.
Karakteristik Senyawa OBA
Metabolit Primer
Tersebar merata dalam tiap organisme
Fungsi universal, sumber energi, enzim, pengemban keturunan bahan struktur
Perbedaan struktur kimia kecil
Keaktifan fisiologis berkaitan dengan struktur kimia
Metabolit Sekunder
Tidak merata
Fungsi ekologis adl penarik serangga, pelindung diri, alat bersaing, hormon
Struktur kimia berbeda-beda
Keaktifan fisiologis berkaitan dengan struktur kimia
METABOLIT SEKUNDER (SENYAWA OBA)
Menurut Herbert (1995), metabolit sekunder mempunyai kriteria sebagai berikut :
Penyebarannya lebih terbatas.
Terdapat pada tanaman dan mikroorganisme tertentu serta mempunyai karakteristik untuk setiap genera, spesies atau suatu strain tertentu.
Metabolit tersebut dibentuk melalui jalur yang khusus dari metabolit primer.
Fungsi senyawa metabolit sekunder secara umum yaitu.
Pertahanan diri dari serangan herbivora : insekta, moluska dan vertebrata.
Pertahanan diri terhadap mikroorganisme : bakteri, fungi dan virus.
Berfungsi sebagai proteksi terhadap sinar ultra violet, atraktan terhadap polinator dan untuk proses penyebaran biji.
Biosintesis senyawa bioaktif atau metabolit sekunder sangat beragam tergantung golongan senyawa yang bersangkutan.
Prazat atau senyawa awal pembentuk metabolit sekunder berasal dari metabolisme primer
Pada gambar ditunjukkan bagaimana metabolit (prazat) terbentuk dari proses dasar yaitu fotosintesis, glikolisis, daur krebs yang menghasilkan energi pada metabolisme antara. Sejumlah prazat diperlukan, namun jenisnya terbatas, sehingga metabolisme dapat berlangsung dari hanya beberapa prazat yang terbatas.
prazat yang sangat penting digunakan dalam biosintesis metabolit sekunder diturunkan dari zantara asetil koenzim A (acetyl-CoA), asam sikimat, asam mevalonat. Zantara ini diperlukan secara berturutan dalam jalur asetat, sikimat dan mevalonat, yang merupakan dasar biosintesis metabolit sekunder (Dewick, 2002).
1. SENYAWA ISOPRENOID (JALUR MEVALONAT)
Berbagai produk tumbuhan yg memiliki beberapa sifat umum lipid membentuk beraneka golongan senyawa, golongan ini dinamakan isoprenoid, terpenoid atau terpen (untuk isoprenoid tanpa oksigen & merupakan hidrokarbon murni).
Yang termasuk isoprenoid antara lain adalah : hormon seperti giberelin dan asam absisat, farnesol (sebagai pengatur stomata pada gandum), xantoksin (prazat hormon asam absisat), sterol, karotenoid, turpentin,
Banyak isoprenoid bersifat mempengaruhi tumbuhan lain atau hewan sehingga menguntungkan tumbuhan yg mengandungnya.
Senyawa kimia (tidak termasuk makanan) yg mempengaruhi spesies lain disebut ZAT ALELOKIMIA.
ALELOPATI adalah keadaan khusus alelokimia yang melibatkan interaksi kimiawi negatif antara spesies tumbuhan yang berbeda
STEROL
Semua sterol (alkohol steroid) adalah triterpenoid. Sterol yg paling banyak di ganggang hijau dan tumbuhan tingkat tinggi adalah sitosterol, stigmasterol, kampesterol, kolesterol, ergosterol (umumnya di fungi yg diubah oleh radiasi UV matahari menjadi vit. D) dan anteridiol (senyawa penarik sexual yg dikeluarkan oleh galur betina fungi air Achlya bisexual).
Sterol terdapat di semua membran dari semua organisme kecuali bakteri, yg memiliki fungsi utama dalam stabilitas membran, selain itu juga memilki aktivitas alelokimia.
KAROTENOID
Karotenoid adalah kelompok isoprenoid yg berhubungan fungsinya dalam fotosintesis. Karotenoid adalah pigmen berwarna kuning, jingga atau merah yang terdapat di berbagai macam plastid berwarna (kromoplas) di akar, batang, daun, bunga dan buah berbagai tumbuhan.
β-karoten merupakan karotenoid yg paling banyak dijumpai pada tumbuhan tingkat tinggi dan menyebabkan akar wortel berwarna jingga. Likopen merupakan jenis karoten yg memberi warna merah pada buah tomat. Lutein merupakan suatu xantofil yg terdapat banyak di daun.
Fungsi karotenoid di daun yaitu karotenoid di kloroplas berperan dalam fotosintesis, dan karoten lainnya mencegah fotooksidasi klorofil.
β-karoten bertindak sebagai antioksidan melindungi dari kanker
ANEKA ISOPRENOID DAN MINYAK ESENSIAL
Unit isoprenoid yg dipadatkan menjadi senyawa cincin yg umumnya mengandung jumlah atom karbon 10 (monoterpenoid), 15 (sesquiterpenoid), 20 (diterpenoid) atau 30 (triterpenoid).
Minyak esensial adalah terpenoid yg mengandung 10 atau 15 karbon, bersifat mudah menguap (bersifat atsiri) dan menyebabkan aroma (bau) pada spesies terntentu, antara lain 71 senyawa atsiri di kulit jeruk merupakan sebagian besar monoterpenoid, terutama limonen.
Nama sinonim: Minyak penguap, volatile oils, essentiale oils.
Definisi: Minyak atsiri adalah produk yang kompleks komponennya, yang berasal dari tumbuhan tertentu.
Salah satu minyak esensial adalah turpentin yg terdapat di sel khusus genus Pinus. Senyawa ini dan sejenisnya misalnya mirsen dan limonen merupakan terpenoid paling beracun bagi kumbang kayu yg mematikan pohon. Pada Pinus senyawa limonen merupakan penolak serangga.
Turunan terpenoid lainya yi glaukolida A yg sebagian besar hanya dijumpai pd Asteraceae, rasanya pahit sehingga mengganggu berbagai serangga dan mamalia pengunyah
Resin yg umum terdapat pada pohon konifer dan beberapa Angiospermae tropis bersifat melindungi pohon terhadap berbagai macam serangga.
DISTRIBUSI MINYAK ATSIRI
Minyak atsiri tersebar dlm tumbuhan tinggi sekitar 17.500 jenis. Beberapa marga a.l. Myrtaceaea, Lauraceae, Rutaceae, Lamiaceae, Asteraceae, Apiaceae, Cupressaceae, Poaceae, Zingibera-ceae, dan Piperaceae.
Minyak atsiri terkumpul pada bunga (bergamot, kenanga, melati, mawar), daun (kayuputih, eukaliptus, sereh, pandan wangi, minyak daun cengkeh), buah (anisi, foeniculi, staranise), kulit kayu (kayu manis jangan, mesoyi), akar (akar wangi), kayu (cendana, gaharu), rimpang (jahe, temulawak, kunyit), dan biji (pala).
AKUMULASI MINYAK ATSIRI
Minyak atsiri terkumpul dalam organ tanaman tertentu, misalnya: dalam sel minyak (Lauraceae dan Zingberaceae), rambut kelenjar (Lamiaceae=Labiatae), ruang sekrit (Rutaceae dan Myrtaceae), saluran sekrit (Apiaceae dan Asteraceae).
FUNGSI
Secara biologi fungsi minyak atsiri bagi tumbuhan belum jelas benar, namun kemungkinan berperan dlm segi ekologi. Misalnya dalam alelopati, minyak atsiri dapat menghambat pertumbuhan tumbuhan di sekelilingnya; menghambat perkecambahan; pelindung terhadap predator, dan penarik hewan (insekta, burung, kelelawar) untuk penyerbukan
MANFAAT MINYAK ATSIRI
Farmasi, m.a. digunakan sebagai aromaterapi, dapat tersedia dlm berbagai bentuk.
Parfumeri, sebagai pengharum dalam berbagai bentuk dan tergantung keperluan. Juga dalam kosmetika.
Teknologi makanan, sebagai bumbu (spices), pengawet, penyedap rasa (flavoring agent).
Prazat untuk sintesis. Misalnya eugenol menjadi vanilin.
2. SENYAWA FENOL (JALUR SIKIMAT)
Senyawa yg termasuk fenol antara lain : asam sinamat, p-kumarat, kafeat, ferulat, klorogenat, galat dan protokatekuat.
Asam protokatekuat dan klorogenat mempunyai fungsi khusus dalam resistensi penyakit pada tumbuhan tertentu. Asam protokatekuat merupakan salah satu senyawa yg mencegah corengan pada varietas bawang berwarna tertentu yg disebabkan oleh fungi Colletotrichum circinans.
Pada tanama kultivar tertentu yg tahan penyakit, asam klorogenat dan senyawa yg serupa tertentu segera terbentuk dan teroksidasi menjadi quinon yg bersifat fungistatis kuat. Sehingga infeksi terlokalisasi dg baik pada tumbuhan yang resisten.
Asam ferulat berperan dalam perlindungan tumbuhan dengan membentuk bagian dari fraksi fenol pada suberin.
Asam galat yang dirubah menjadi galotanin merupakan senyawa yg sangat menghambat pertumbuhan tanaman. Galotanin bertindak sebagai senyawa alelopati, menghambat pertumbuhan spesies lain yg tumbuh di sekitar tumbuhan yg mengandung dan melepaskannya.
FITOALEKSIN, ELISITOR DAN PERLINDUNGAN PENYAKIT TANAMAN
Kelompok senyawa antimikroba yang disintesis tumbuhan bila terinfeksi oleh mikroba disebut sebagai fitoaleksin. Pada umumnnya fitoaleksin jauh lebih beracun terhadap fungi daripada bakteri.
Senyawa yg bertindak sebagai fitoaleksin antara lain :
Gliseoin di akar kedelai, pisatin di polong kapri, faseolin di polong buncis, lipomeamaron di akar umbi jalar, arkinol di umbi anggrek.
Sebagian besar fitoaleksin adalah fenilpropanoid fenol, beberapa senyawa merupakan isoprenoid dan poliasetilen.
Beraneka macam senyawa, bahkan virus, dapat meningkatkan produksi fitoaleksin.
Senyawa yang menyebabkan diproduksinya fitoaleksin disebut elisitor, walaupun elisitor jg mendorong tumbuhan untuk mengaktifkan reaksi pertahanan lainnya.
Beberapa elisitor merupakan polisakarida yg dihasilkan bila fungi atau bakteri patogenik menyerang dinding sel tumbuhan, sedangkan elisitor lainnya adalah polisakarida yg dihasilkan dari perombakan dinding sel fungi oleh enzim tumbuhan yg dikeluarkan oleh tumbuhan karena fungi.
3. ALKALOID (JALUR SIKIMAT)
Tumbuhan yg menggandung senyawa nitrogen aromatik dikenal dg alkaloid (berasal dr turunan as. Amino tertentu a.l. fenilalanin, tirosin, triptofan, lisin, ornitin dll)
Alkaloid menarik krn aktivitas fisiologis dan psikologisnya yg dramatis pd manusia dan hewan lain serta karena dipercaya bahwa banyak di antaranya yg juga mempunyai peranan penting dalam tumbuhan (a.l. melindungi tumbuhan).
Lebih dr 3000 alkaloid telah ditemukan dlm 4000 spesies tumbuhan, paling sering pada dikotil herba. Hanya beberapa monokotil dan Gimnospermae yg mengandung alkaloid
Alkoloid pertama yg diisolasi dan dikristalkan adalah obat bius morfin, diisolasi pd th 1805 dr Papaver somniverum
Alkaloid yang terkandung dalam opium, yaitu dengan mendaras getah yang diambil dari buah yang tua tetapi belum masak dari tanaman Papaver somniferum L. (suku Papaveraceae)
4. FLAVONOID (JALUR SIKIMAT)
Terdapat 3 kelompok flavonoid yg menarik dalam fisiologi tumbuhan yaitu : antosianin, flavonol dan flavon
Sebagian besar flavonoid terhimpun di vakuola tengah, meskipun disintesis di luar vakuola
Antosianin
Merupakan pigmen berwarna yg umumnya pd bunga merah, ungu dan biru. Tp terdapat jg pada bagian tumbuhan lain mis. buah, batang, daun dan akar. Antosianin umumnya tdk terdapat pd lumut hati, ganggang dan tumbuhan rendah lainya.
Fungsi antosianin a.l. utk membantu penyerbukan pd bunga dg menarik perhatian lebah dan burung yg membawa serbuk sari
Flavonol dan flavon
Berhubungan dekat dg antosianin tp berbeda dlm struktur cincin tengah yg mengandung oksigen
Sebagian besar flavon dan flavonol merupakan pigmen berwarna kekuningan atau gading pada bunga
Molekul flavon & flavonol jg tersebar di daun, berperan sebagai pencegah pemakan daun krn menyerap radiasi UV, berperan sebagai pelindung terhadap cahaya UV gelombang panjang
Rabu, 22 Juni 2011
PEMINDAHAN GEN
TRANSFORMASI : hanya genom yang keluar (diabsorbsi dari lingkungan)
KONJUGASI : dimediasi oleh plasmid, harus ada penempelan
TRANSDUKSI : pemindahan gen dengan bantua virus
Bakterial Conjugation :
Prinsip : memerlukan kontak antar bakteri. Tidak dapat terjadi mutasi balik secara konstan. Bakteri menggunakan pilus (phili) untuk transfer genetik. Pilus bakteri donor akan menempel pada bakteri resipien kemudia terbentuk jembatan konjugasi dari ruang sel bakteri sehingga terjadilah pemindahan gen dan pembentukan plasmid baru.
Yang digunakan adalah plasmid karena kromosom memiliki ukuran gen dengan bp yang lebih tinggi sehingga proses pemindahannya akan memerlukan waktu yang lama, sedangkan proses matting hanya berlangsung sebentardimana fertility factor terdapat pada ujung kromosom sebelem F dapat ditransfer ke resepien, perkawinan terhenti & donot tidak dapat/jarang menjadi F. Integrasi F faktor bersifat pseudo random (dapat menempel dimana saja).
Bakteri memerlukan feromon untuk mengekspresikan gen tra. 1 feromon akan memicu pembetukan 1 plasmid yang transmisible. Peranan feromon pada resepien terdapat pada kromosom dan pada pendonor Tra A mengekspresikan transkipsi en. Tra C mengkodekan protein dipermukaan sel yang dapat mengenali feromon. Sehingga terjadi matting dimana feromon masuk melalui sistem oligopeptida permease. Feromon mengikat TraA (dlepas dari DNA) memicu sintesis Tra E.
Klonning selain pada E.coli :
Salah satunya dengan menggunakan saccharomyces. Alasan menggunakan yeast adalah : mewakili eukariot, sequencing lengkap sehingga mudah untuk digunakan, rekayasa dapat dilakukan dengan cara menghilangkan gen spesifik dari yeas menggunakan plasmid yeast, siklus hidunya juga cepat sehingga sintesis biologisnya juga cepat, pda proses rekombinasi homolog gen kedalam plasmid yeast memungkinkan terjadinya intregasi menghasilkan 2 kopi.
Fungi berfilamen inang sbg ekspresi ;
1. Tumbuhnya cepat 2. Media pertumbhannya murah. 3. Level ekspresinya banyak. 4. Kapasitas sekresinya besar. 5. Dapat melakukan tasonal modification
A.tumefaciens : merupakan bakteri yang menyebabkan tumor pada tumbuhan dikotiledon yang disebabkan adanya plasmid Ti. Merupakan media untuk memasukkan DNA asing pada tanaman. pada dasarnya bakteri mentransfer bagian dari Dna nya sendiri ke tanaman. Dna ini akan berintregasi ke genome tanaman yang menyebabkan terjadinya tumor dan berasosiai utuk memodifikasi / merubah metabolisme. A. Tumefaciens memiliki plasmid Ti yaitu plasmid yang digunakan untuk mentransfer gen yang diinginkan. Ketika terintregarasi pada sel tanaman, makan TDNA akan mengkode : produksi sitokini, produksiasam indoleacatic dan sintesi dan pelepasan hasil metabolisme.
SEKUENSING DNA
Merupakan metode untuk menentukan urtan2 basa nukleotida dalam satu gen danasam nukleat. Analisis sekuen meupaka suatu teknik yang dianggap paling baik untuk melihat keanekaragaman hayati suatu kelompk mikroorganisme.
Teknik kimia
-prinsipnya adalah degrada struktur kimia DNA. Kekurangan dari metode ini adalah Dna yang disntesin kurang dari <250 bp. Dan kelebihannya adalah menggunakan bahan kima yang mudah didapat. Metode ini memerlukan label radioaktif pada ujung satu dan pemurnian framgen DNA yang akan disekuen. Fragmen pada ke-empat reaksi diatur bersebelahan pada gel elektroforesis untuk pemisahan berdasarkan ukuran. Untuk memvisualisasi fragmen, gel diekspos kepada X-ray film untuk autoradiografi. menghasilkan sebuah seri band yang gelap yang masing-masing mewakili fragmen DNA yang diradiolabel.
Metode dedioxy
Chain terminator method : ujung 3’ OH tidak dapat membentuk polimer pada ujung ddNTP
Campuran dari semua dNTP
dATP, dGTP, dCTP, dTTP
Campuran dari semua ddN TP dlm jumlah terbatas, ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP
Senyawa yg diperlukan :
Primer : komplementer dg DNA yg akan disekuen
Template : dapt berupa utas tunggal/ganda
DNA Polimerase
2′,3′-Dideoksiribonukleosida trifosfat:
2′,3′-Dideoksiribotimidin trifosfat(ddTTP)
ii. 2′,3′-Dideoksiribositidin trifosfat(ddCTP)
iii. 2′,3′-Dideoksiriboadenosin trifosfat(ddATP)
iv. 2′,3′-Dideoksiriboguanosin trifosfat(ddGTP)
Setelah fragmen DNA dipisah menjadi 4 reaksi paralel dan diperoleh rantai template dengan proses denaturasi, kemudian dipisah oleh elektroforesis gel poliakrilamid dan posisinya akan dideteksi oleh autoradiografi.
Fragmen terpendek akan pindah ke jarak terjauh dan mengarah ke anoda.
MUTAGENESIS
1. Deletion mutagenesis
2. Site-directed mutagenesis
3. PCR mutagenesis
Salah satu keuntungan dapat diisolasi dan dikloningnya gen adalah kemudahan untuk memodifikasi gen (sekuen as.amino, menyisipkan gen buatan) ke dlm protein melalui teknologi DNA rekombinan.
Mutagenesis digunakan untuk :
1. Mempelajari hubungan antara struktur protein dan fungsi biologi
2. Mengkarakterisasi sekuen promoter
3. Sekuen DNA spesifik diperlukan utk menjelaskan karakteristik sekuen promoter
DELETION MUTAGENESIS (mutagenesis delesi) merupakan teknik yg sederhana dengan menghilangkan sekuen dari kedua ujung dari klon cDNA menggunakan enzim seperti exonuclease III (memotong rantai nukleotida dari arah 3 '-ke-5' ). Dengan waktu inkubasi tertentu enzim ini akan menghilangkan urutan DNA insert sehingga menghasilkan fragmen lebih pendek. Enzim lain, nuklease S1 (Nuklease kacang hijau) digunakan untuk menumpulkan ujung untai DNA. Setelah itu, plasmid rekombinan diligasi kembali dan digunakan untuk transformasi bakteri. Metode ini umumnya digunakan untuk memasukkan urutan cDNA yang besar, juga digunakan untuk menghapus coding sequence untuk menghapus gugus karboksil atau ujung amino dan menghasilkan potongan protein.
Proses deletion mutagenesis : rekombinan plasmid à diinkubasi dngan exonuclease untuk memotong DNAàdiinkubasi dengan S1àdiligasi dengan ‘t4 DNA ligaseàplasmid ditransformasi.
SITE-DIRECTED MUTAGENESIS
Merupakan teknik yang sangat memerlukan energi dimana perubahan situs tertentu pada sekuen DNA dihasilkan secara invitro, sebagai contoh untuk merubah sisa asam amino kedalam bentuk lain dengan merubah codon sequence dalam urutan gen.
SDM juga digunakan untuk merekayasa protein untuk berbagai tujuan seperti :
Peningkatan kestabilan, merubah kespesifikan dan mengurangi toksisitas.
Oligonucleotide-based mutagenesis is the most commonly used method to introduce mutations in coding sequence = site-direct mutagenesis
PCR MUTAGENESIS dapat digunakan untuk menghasilkan delesi atau mutasi titik.
Memerlukan primer : forward dan reverse
TRANSFORMASI : hanya genom yang keluar (diabsorbsi dari lingkungan)
KONJUGASI : dimediasi oleh plasmid, harus ada penempelan
TRANSDUKSI : pemindahan gen dengan bantua virus
Bakterial Conjugation :
Prinsip : memerlukan kontak antar bakteri. Tidak dapat terjadi mutasi balik secara konstan. Bakteri menggunakan pilus (phili) untuk transfer genetik. Pilus bakteri donor akan menempel pada bakteri resipien kemudia terbentuk jembatan konjugasi dari ruang sel bakteri sehingga terjadilah pemindahan gen dan pembentukan plasmid baru.
Yang digunakan adalah plasmid karena kromosom memiliki ukuran gen dengan bp yang lebih tinggi sehingga proses pemindahannya akan memerlukan waktu yang lama, sedangkan proses matting hanya berlangsung sebentardimana fertility factor terdapat pada ujung kromosom sebelem F dapat ditransfer ke resepien, perkawinan terhenti & donot tidak dapat/jarang menjadi F. Integrasi F faktor bersifat pseudo random (dapat menempel dimana saja).
Bakteri memerlukan feromon untuk mengekspresikan gen tra. 1 feromon akan memicu pembetukan 1 plasmid yang transmisible. Peranan feromon pada resepien terdapat pada kromosom dan pada pendonor Tra A mengekspresikan transkipsi en. Tra C mengkodekan protein dipermukaan sel yang dapat mengenali feromon. Sehingga terjadi matting dimana feromon masuk melalui sistem oligopeptida permease. Feromon mengikat TraA (dlepas dari DNA) memicu sintesis Tra E.
Klonning selain pada E.coli :
Salah satunya dengan menggunakan saccharomyces. Alasan menggunakan yeast adalah : mewakili eukariot, sequencing lengkap sehingga mudah untuk digunakan, rekayasa dapat dilakukan dengan cara menghilangkan gen spesifik dari yeas menggunakan plasmid yeast, siklus hidunya juga cepat sehingga sintesis biologisnya juga cepat, pda proses rekombinasi homolog gen kedalam plasmid yeast memungkinkan terjadinya intregasi menghasilkan 2 kopi.
Fungi berfilamen inang sbg ekspresi ;
1. Tumbuhnya cepat 2. Media pertumbhannya murah. 3. Level ekspresinya banyak. 4. Kapasitas sekresinya besar. 5. Dapat melakukan tasonal modification
A.tumefaciens : merupakan bakteri yang menyebabkan tumor pada tumbuhan dikotiledon yang disebabkan adanya plasmid Ti. Merupakan media untuk memasukkan DNA asing pada tanaman. pada dasarnya bakteri mentransfer bagian dari Dna nya sendiri ke tanaman. Dna ini akan berintregasi ke genome tanaman yang menyebabkan terjadinya tumor dan berasosiai utuk memodifikasi / merubah metabolisme. A. Tumefaciens memiliki plasmid Ti yaitu plasmid yang digunakan untuk mentransfer gen yang diinginkan. Ketika terintregarasi pada sel tanaman, makan TDNA akan mengkode : produksi sitokini, produksiasam indoleacatic dan sintesi dan pelepasan hasil metabolisme.
SEKUENSING DNA
Merupakan metode untuk menentukan urtan2 basa nukleotida dalam satu gen danasam nukleat. Analisis sekuen meupaka suatu teknik yang dianggap paling baik untuk melihat keanekaragaman hayati suatu kelompk mikroorganisme.
Teknik kimia
-prinsipnya adalah degrada struktur kimia DNA. Kekurangan dari metode ini adalah Dna yang disntesin kurang dari <250 bp. Dan kelebihannya adalah menggunakan bahan kima yang mudah didapat. Metode ini memerlukan label radioaktif pada ujung satu dan pemurnian framgen DNA yang akan disekuen. Fragmen pada ke-empat reaksi diatur bersebelahan pada gel elektroforesis untuk pemisahan berdasarkan ukuran. Untuk memvisualisasi fragmen, gel diekspos kepada X-ray film untuk autoradiografi. menghasilkan sebuah seri band yang gelap yang masing-masing mewakili fragmen DNA yang diradiolabel.
Metode dedioxy
Chain terminator method : ujung 3’ OH tidak dapat membentuk polimer pada ujung ddNTP
Campuran dari semua dNTP
dATP, dGTP, dCTP, dTTP
Campuran dari semua ddN TP dlm jumlah terbatas, ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP
Senyawa yg diperlukan :
Primer : komplementer dg DNA yg akan disekuen
Template : dapt berupa utas tunggal/ganda
DNA Polimerase
2′,3′-Dideoksiribonukleosida trifosfat:
2′,3′-Dideoksiribotimidin trifosfat(ddTTP)
ii. 2′,3′-Dideoksiribositidin trifosfat(ddCTP)
iii. 2′,3′-Dideoksiriboadenosin trifosfat(ddATP)
iv. 2′,3′-Dideoksiriboguanosin trifosfat(ddGTP)
Setelah fragmen DNA dipisah menjadi 4 reaksi paralel dan diperoleh rantai template dengan proses denaturasi, kemudian dipisah oleh elektroforesis gel poliakrilamid dan posisinya akan dideteksi oleh autoradiografi.
Fragmen terpendek akan pindah ke jarak terjauh dan mengarah ke anoda.
MUTAGENESIS
1. Deletion mutagenesis
2. Site-directed mutagenesis
3. PCR mutagenesis
Salah satu keuntungan dapat diisolasi dan dikloningnya gen adalah kemudahan untuk memodifikasi gen (sekuen as.amino, menyisipkan gen buatan) ke dlm protein melalui teknologi DNA rekombinan.
Mutagenesis digunakan untuk :
1. Mempelajari hubungan antara struktur protein dan fungsi biologi
2. Mengkarakterisasi sekuen promoter
3. Sekuen DNA spesifik diperlukan utk menjelaskan karakteristik sekuen promoter
DELETION MUTAGENESIS (mutagenesis delesi) merupakan teknik yg sederhana dengan menghilangkan sekuen dari kedua ujung dari klon cDNA menggunakan enzim seperti exonuclease III (memotong rantai nukleotida dari arah 3 '-ke-5' ). Dengan waktu inkubasi tertentu enzim ini akan menghilangkan urutan DNA insert sehingga menghasilkan fragmen lebih pendek. Enzim lain, nuklease S1 (Nuklease kacang hijau) digunakan untuk menumpulkan ujung untai DNA. Setelah itu, plasmid rekombinan diligasi kembali dan digunakan untuk transformasi bakteri. Metode ini umumnya digunakan untuk memasukkan urutan cDNA yang besar, juga digunakan untuk menghapus coding sequence untuk menghapus gugus karboksil atau ujung amino dan menghasilkan potongan protein.
Proses deletion mutagenesis : rekombinan plasmid à diinkubasi dngan exonuclease untuk memotong DNAàdiinkubasi dengan S1àdiligasi dengan ‘t4 DNA ligaseàplasmid ditransformasi.
SITE-DIRECTED MUTAGENESIS
Merupakan teknik yang sangat memerlukan energi dimana perubahan situs tertentu pada sekuen DNA dihasilkan secara invitro, sebagai contoh untuk merubah sisa asam amino kedalam bentuk lain dengan merubah codon sequence dalam urutan gen.
SDM juga digunakan untuk merekayasa protein untuk berbagai tujuan seperti :
Peningkatan kestabilan, merubah kespesifikan dan mengurangi toksisitas.
Oligonucleotide-based mutagenesis is the most commonly used method to introduce mutations in coding sequence = site-direct mutagenesis
PCR MUTAGENESIS dapat digunakan untuk menghasilkan delesi atau mutasi titik.
Memerlukan primer : forward dan reverse
klonning gen selain e.coliii
KLONING GEN SELAIN DENGAN E.COLI
Untuk percobaan banyak akan lebih mudah untuk menggunakan E. coli sebagai penerima untuk gen kloning dari eukariota atau prokariota lain.
Transformasi mudah dan tersedia berbagai macam vektor yang mudah digunakan. Namun, penggunaan E. coli tidak selalu praktis karena tidak memiliki beberapa jalur biokimia tambahan yang penting untuk ekspresi fenotipik fungsi tertentu, misalnya degradasi senyawa aromatik, sintesis antibiotik, patogenisitas,sporulasi, dll
Dalam keadaan seperti itu,
gen harus dikloning kembali menjadi spesies yang serupa
(asal).
Syarat untuk kloning gen dalam
inang baru.
Pertama, harus ada sebuah metode untuk
memperkenalkan DNA yang diinginkan yang berpotensi sbg
penerima.
Metode yang tersedia meliputi transformasi,
konjugasi, dan elektroporasi,
Kedua,DNA yang diintroduksi perlu
dipelihara dalam inang yg baru.
sebagai replicon melalui lingkungan baru atau diintegrasikan ke dalam kromosom atau plasmid yang sudah ada sebelumnya.
Akhirnya, penyerapan dan pemeliharaan kloning gen hanya akan dideteksi jika diekspresikan.
Jadi ketidakmampuan untuk mendeteksi kloning gen dalam bakteri baru bisa disebabkan oleh kegagalan untuk memperkenalkan gen, untuk mempertahankan atau untuk mengekspresikan, atau kombinasi faktor-faktor tersebut.
DNA dapat ditransfer diantara berbagai strain
E. coli oleh tiga metode klasik konjugasi,
transduksi, dan transformasi, serta
dengan metode terbaru dari elektroporasi
Transformasi dalam organisme berbeda
dalam beberapa hal dari E. coli.
Pertama, dengan pengecualian
Neisseria gonorrhoeae, kompetensi untuk transformasi
adalah transient phenomenon.
Kedua, transformasi
dapat disequen secara independen, seperti Bacillus subtilis
dan Acinetobacter calcoaceticus, tetapi spesies lain
(Hemophilus influenzae, N. gonorrhoeae) itu tergantung
pada keberadaan spesific uptake sequence.
Ketiga,
mekanisme transformasi alam melibatkan
pembelahannuklease dari DNA dan degradasi dari salah satu dari dua alur sehingga terbentuk untai tunggal yang bisa masuk sel.
developed specialized methods for overcoming this problem (see Box. 10.1). For work with other species, electroporation (see p. 25) offers a much simpler
alternative although the efficiency may be very low.
For example, in Methanococcus voltae electroporation
yielded only 102 transformants/μg plasmid DNA (Tumbula & Whitman 1999)
Cloning in Gram-negative bacteria other than E. coli
Dalam keadaan normal,
E. coli akan digunakan sebagai inang sementara untuk transformasi
ligasi dan screening
plasmid rekombinan. Oleh karena itu, vektor harus dapat mereplikasi pada E. coli sebaik pada shuttle vektor
atau menggunakan broad-host-range plasmid sebagai vektor.
Jika
sebuah plasmid kecil dapat diisolasi dari bakteri
yang diinginkan, maka mudah untuk menyambungnya ke dalam vektor E. coli untuk menghasilkan shuttle vektor. Sebagai contoh adalah vektor yang digunakan dalam Pasteurella (Bills et al 1993).,
Desulfovibrio (Rousset et al 1998)., Dan Thermus
(De Grado et al 1999)..
Dengan broad-host-range plasmid, ada
probabilitas tinggi bahwa marker yang dipilih akan diekspresikan
di Inang baru. Namun, secara alami
plasmid yang ada tidak memenuhi semua kriteria untuk
vektor ideal, yaitu:
• ukuran kecil:
• memiliki beberapa selectable marker;
• mpembatasanmiliki situs yang unik untuk beberapa enzim restriksi
Akibatnya, plasmid alami telah banyak
diubah, tetapi yang paling mendekati
ditemukan dalam E. coli vektor standar.
Cloning in Gram-positive bacteria
Pada bakteri gram positif, komposisi dasar genome adalah <30% GC hingga >70% GC.
Dengan adanya perbedaan dalam isi GC,
kodon yang dipilih dan peraturan sinyal yang digunakan oleh
organisme di salah satu ujung spektrum % GC tidak akan
diterima oleh organisme di ujung lain, berarti bahwa tidak ada kendaraankloning universal
untuk digunakan dengan semua bakteri Gram-positif.
Organisme high-GC (ex.Streptomycetes) dan lainnya untuk organisme low-GC (Bacillus, Clostridium,
dan Staphylococcus dan the lactic acid bacteria
Streptococcus, Lactococcus, and Lactobacillus)
KLONING DI SACCHAROMYCES CEREVISIAE
dan jamur
Ada sejumlah alasan untuk kloning
DNA dalam S. cerevisiae
Ketika teknologi DNA rekombinan pertama kali diterapkan pada jamur pada akhir tahun 1970 organisme pilihan adalah ragi Saccharomyces cerevisiae. Pada saat itu
tujuan utama kloning adalah untuk memahami
gen tertentu apa yang dilakukan di vivo
pengembangan metodologi sekuensing DNA memfasilitasi identifikasi unsur-unsur yang berbeda yang mengontrol ekspresi gen pada jamur
Alasan sekunder untuk kloning dalam ragi adalah untuk memahami fungsi-fungsi seluler yang unik untuk eukariota seperti
mitosis, meiosis, transduksi sinyal, diferensiasi selular obligat, dll
Saat ini, ada alasan berbeda untuk kloning di S. cerevisiae dan jamur lainnya.
Alasan kedua untuk kepentingan saat ini dalam manipulasi gen pada jamur adalah kelebihan produksi protein nilai komersial.
Jamur menawarkan sejumlah keunggulan, seperti kemampuan untuk glycosylate protein, tidak adanya oxins t pyrogenic, dan dalam Pichia pastoris caseof dengan ragi methylotrophic, kemampuan untuk mendapatkan hasil yang sangat tinggi dari protein rekombinan.
Ragi dan jamur lainnya banyak digunakan dalam makanan dan DNA rekombinan productionof
teknologi dapat digunakan untuk meningkatkan sifat yang diinginkan mereka.
Alasan ketiga untuk kepentingan saat ini dalam aplikasi teknologi DNA rekombinan dalam ragi adalah kemampuan untuk mengkloning potongan DNA yang sangat besar, merupakan persyaratan penting bagi banyak-genom seluruh studi. Meskipun tidak ada batasan teoritis untuk ukuran DNA yang dapat dikloning dalam plasmid bakteri dalam prakteknya ditemukan bahwa menyisipkan besar menyebabkan ketidakstabilan struktural dan yg tdk suka bergaul dgn orang lain.
Vektor ragi tertentu (YACs, hal 213) dapat menerima menyisipkan lebih besar dari 1 Mb, jauh lebih besar dari yang ditemukan di BAC dan PAC. Meskipun YACs awal memiliki kecenderungan untuk menjadi tidak stabil masalah ini sebagian besar telah eliminatedin generasi baru YACs.
Jamur tidak alami transformable dan
metode khusus yang diperlukan untuk memperkenalkan
eksogen DNA
Seperti E.coli jamur secara alamiah dapat Tidak ditranform, UNTUK memperkenalkan DNA Asing digunakan jamur buatan (Rekayasa).
Salah Satu metodenya adl speroplas (sel berdinding Tidak) Yang Pertama kali dikembangkan UNTUK S. cerevisieae
PADA METODE ini, Dinding sel dihilangkan dg menggunakan enzim, speroplast yg dihasilkan etilen glikol difusi menggunakan DENGAN DNA murah CaCl2.
Speroplas kemudian dibiarkan UNTUK membentuk Dinding sel baru PADA media agar-agar penstabil mengandung 3%.
Langkah tersebut cara membuat sel Penerimaan Lebih Mudah.
Elektroporasi menyediakan alternatif yg Lebih Mudah utk penggunaan speroplast. Sel ditransformasi dg elektroporasi diseleksi dpt pd permukaan media Padat.
METODE speroplast murah elektoporasi Sudah digunakan PADA Berbagai Jenis ragi murah jamur.
DNA dpt diintroduksikan ke dlm ragi jamur murah dg konjugasi Heinemann & Sprague (1989) dan Sikorski et al. (1990) menemukan bahwa plasmid enterobacterial, seperti R751 (IncPβ) dan F (incf), dapat memfasilitasi transfer plasmid dari E. coli untuk cerevisiae S. dan pombe Schizosaccharomyces.
Bakteri patogen Agrobacterium tumefaciens Tanaman gede yg mengandung plasmid, plasmid Ti
BAGIAN murah ini plasmid (yaitu DNA T-) dapat ditransfer ke dlm scr konjugatif protoplas S. cerevisiae (Bundock et al, 1995.) murah beberapa jamur (De Groot et al. 1998). T-DNA dapat juga ditransfer kedlm HIFA murah konidia.
Eksogen DNA yang tidak dilakukan pada vektor
hanya dapat dipertahankan dengan integrasi ke dalam
kromosom
Ketika T-DNA dari Ti plasmid dari Agrobacterium ditransfer ke ragi, juga akan memasukkan di bagian yang berbeda dari genom dengan rekombinasi tidak sah (Bundock & Hooykaas 1996).
Berbagai jenis vektor telah
dikembangkan untuk digunakan dalam S. cerevisiae
Jika DNA heterolog diperkenalkan ke jamur harus dipertahankan dalam keadaan ekstrakromosomal maka vektor-vektor plasmid yang diperlukan yang mampu mereplikasi di host jamur.
Empat jenis vektor plasmid telah dikembangkan: plasmid ragi episomal (YEps), plasmid ragi replikasi (YRps), sentromer plasmid ragi (YCps), dan kromosom buatan ragi (YACs).
Untuk percobaan banyak akan lebih mudah untuk menggunakan E. coli sebagai penerima untuk gen kloning dari eukariota atau prokariota lain.
Transformasi mudah dan tersedia berbagai macam vektor yang mudah digunakan. Namun, penggunaan E. coli tidak selalu praktis karena tidak memiliki beberapa jalur biokimia tambahan yang penting untuk ekspresi fenotipik fungsi tertentu, misalnya degradasi senyawa aromatik, sintesis antibiotik, patogenisitas,sporulasi, dll
Dalam keadaan seperti itu,
gen harus dikloning kembali menjadi spesies yang serupa
(asal).
Syarat untuk kloning gen dalam
inang baru.
Pertama, harus ada sebuah metode untuk
memperkenalkan DNA yang diinginkan yang berpotensi sbg
penerima.
Metode yang tersedia meliputi transformasi,
konjugasi, dan elektroporasi,
Kedua,DNA yang diintroduksi perlu
dipelihara dalam inang yg baru.
sebagai replicon melalui lingkungan baru atau diintegrasikan ke dalam kromosom atau plasmid yang sudah ada sebelumnya.
Akhirnya, penyerapan dan pemeliharaan kloning gen hanya akan dideteksi jika diekspresikan.
Jadi ketidakmampuan untuk mendeteksi kloning gen dalam bakteri baru bisa disebabkan oleh kegagalan untuk memperkenalkan gen, untuk mempertahankan atau untuk mengekspresikan, atau kombinasi faktor-faktor tersebut.
DNA dapat ditransfer diantara berbagai strain
E. coli oleh tiga metode klasik konjugasi,
transduksi, dan transformasi, serta
dengan metode terbaru dari elektroporasi
Transformasi dalam organisme berbeda
dalam beberapa hal dari E. coli.
Pertama, dengan pengecualian
Neisseria gonorrhoeae, kompetensi untuk transformasi
adalah transient phenomenon.
Kedua, transformasi
dapat disequen secara independen, seperti Bacillus subtilis
dan Acinetobacter calcoaceticus, tetapi spesies lain
(Hemophilus influenzae, N. gonorrhoeae) itu tergantung
pada keberadaan spesific uptake sequence.
Ketiga,
mekanisme transformasi alam melibatkan
pembelahannuklease dari DNA dan degradasi dari salah satu dari dua alur sehingga terbentuk untai tunggal yang bisa masuk sel.
developed specialized methods for overcoming this problem (see Box. 10.1). For work with other species, electroporation (see p. 25) offers a much simpler
alternative although the efficiency may be very low.
For example, in Methanococcus voltae electroporation
yielded only 102 transformants/μg plasmid DNA (Tumbula & Whitman 1999)
Cloning in Gram-negative bacteria other than E. coli
Dalam keadaan normal,
E. coli akan digunakan sebagai inang sementara untuk transformasi
ligasi dan screening
plasmid rekombinan. Oleh karena itu, vektor harus dapat mereplikasi pada E. coli sebaik pada shuttle vektor
atau menggunakan broad-host-range plasmid sebagai vektor.
Jika
sebuah plasmid kecil dapat diisolasi dari bakteri
yang diinginkan, maka mudah untuk menyambungnya ke dalam vektor E. coli untuk menghasilkan shuttle vektor. Sebagai contoh adalah vektor yang digunakan dalam Pasteurella (Bills et al 1993).,
Desulfovibrio (Rousset et al 1998)., Dan Thermus
(De Grado et al 1999)..
Dengan broad-host-range plasmid, ada
probabilitas tinggi bahwa marker yang dipilih akan diekspresikan
di Inang baru. Namun, secara alami
plasmid yang ada tidak memenuhi semua kriteria untuk
vektor ideal, yaitu:
• ukuran kecil:
• memiliki beberapa selectable marker;
• mpembatasanmiliki situs yang unik untuk beberapa enzim restriksi
Akibatnya, plasmid alami telah banyak
diubah, tetapi yang paling mendekati
ditemukan dalam E. coli vektor standar.
Cloning in Gram-positive bacteria
Pada bakteri gram positif, komposisi dasar genome adalah <30% GC hingga >70% GC.
Dengan adanya perbedaan dalam isi GC,
kodon yang dipilih dan peraturan sinyal yang digunakan oleh
organisme di salah satu ujung spektrum % GC tidak akan
diterima oleh organisme di ujung lain, berarti bahwa tidak ada kendaraankloning universal
untuk digunakan dengan semua bakteri Gram-positif.
Organisme high-GC (ex.Streptomycetes) dan lainnya untuk organisme low-GC (Bacillus, Clostridium,
dan Staphylococcus dan the lactic acid bacteria
Streptococcus, Lactococcus, and Lactobacillus)
KLONING DI SACCHAROMYCES CEREVISIAE
dan jamur
Ada sejumlah alasan untuk kloning
DNA dalam S. cerevisiae
Ketika teknologi DNA rekombinan pertama kali diterapkan pada jamur pada akhir tahun 1970 organisme pilihan adalah ragi Saccharomyces cerevisiae. Pada saat itu
tujuan utama kloning adalah untuk memahami
gen tertentu apa yang dilakukan di vivo
pengembangan metodologi sekuensing DNA memfasilitasi identifikasi unsur-unsur yang berbeda yang mengontrol ekspresi gen pada jamur
Alasan sekunder untuk kloning dalam ragi adalah untuk memahami fungsi-fungsi seluler yang unik untuk eukariota seperti
mitosis, meiosis, transduksi sinyal, diferensiasi selular obligat, dll
Saat ini, ada alasan berbeda untuk kloning di S. cerevisiae dan jamur lainnya.
Alasan kedua untuk kepentingan saat ini dalam manipulasi gen pada jamur adalah kelebihan produksi protein nilai komersial.
Jamur menawarkan sejumlah keunggulan, seperti kemampuan untuk glycosylate protein, tidak adanya oxins t pyrogenic, dan dalam Pichia pastoris caseof dengan ragi methylotrophic, kemampuan untuk mendapatkan hasil yang sangat tinggi dari protein rekombinan.
Ragi dan jamur lainnya banyak digunakan dalam makanan dan DNA rekombinan productionof
teknologi dapat digunakan untuk meningkatkan sifat yang diinginkan mereka.
Alasan ketiga untuk kepentingan saat ini dalam aplikasi teknologi DNA rekombinan dalam ragi adalah kemampuan untuk mengkloning potongan DNA yang sangat besar, merupakan persyaratan penting bagi banyak-genom seluruh studi. Meskipun tidak ada batasan teoritis untuk ukuran DNA yang dapat dikloning dalam plasmid bakteri dalam prakteknya ditemukan bahwa menyisipkan besar menyebabkan ketidakstabilan struktural dan yg tdk suka bergaul dgn orang lain.
Vektor ragi tertentu (YACs, hal 213) dapat menerima menyisipkan lebih besar dari 1 Mb, jauh lebih besar dari yang ditemukan di BAC dan PAC. Meskipun YACs awal memiliki kecenderungan untuk menjadi tidak stabil masalah ini sebagian besar telah eliminatedin generasi baru YACs.
Jamur tidak alami transformable dan
metode khusus yang diperlukan untuk memperkenalkan
eksogen DNA
Seperti E.coli jamur secara alamiah dapat Tidak ditranform, UNTUK memperkenalkan DNA Asing digunakan jamur buatan (Rekayasa).
Salah Satu metodenya adl speroplas (sel berdinding Tidak) Yang Pertama kali dikembangkan UNTUK S. cerevisieae
PADA METODE ini, Dinding sel dihilangkan dg menggunakan enzim, speroplast yg dihasilkan etilen glikol difusi menggunakan DENGAN DNA murah CaCl2.
Speroplas kemudian dibiarkan UNTUK membentuk Dinding sel baru PADA media agar-agar penstabil mengandung 3%.
Langkah tersebut cara membuat sel Penerimaan Lebih Mudah.
Elektroporasi menyediakan alternatif yg Lebih Mudah utk penggunaan speroplast. Sel ditransformasi dg elektroporasi diseleksi dpt pd permukaan media Padat.
METODE speroplast murah elektoporasi Sudah digunakan PADA Berbagai Jenis ragi murah jamur.
DNA dpt diintroduksikan ke dlm ragi jamur murah dg konjugasi Heinemann & Sprague (1989) dan Sikorski et al. (1990) menemukan bahwa plasmid enterobacterial, seperti R751 (IncPβ) dan F (incf), dapat memfasilitasi transfer plasmid dari E. coli untuk cerevisiae S. dan pombe Schizosaccharomyces.
Bakteri patogen Agrobacterium tumefaciens Tanaman gede yg mengandung plasmid, plasmid Ti
BAGIAN murah ini plasmid (yaitu DNA T-) dapat ditransfer ke dlm scr konjugatif protoplas S. cerevisiae (Bundock et al, 1995.) murah beberapa jamur (De Groot et al. 1998). T-DNA dapat juga ditransfer kedlm HIFA murah konidia.
Eksogen DNA yang tidak dilakukan pada vektor
hanya dapat dipertahankan dengan integrasi ke dalam
kromosom
Ketika T-DNA dari Ti plasmid dari Agrobacterium ditransfer ke ragi, juga akan memasukkan di bagian yang berbeda dari genom dengan rekombinasi tidak sah (Bundock & Hooykaas 1996).
Berbagai jenis vektor telah
dikembangkan untuk digunakan dalam S. cerevisiae
Jika DNA heterolog diperkenalkan ke jamur harus dipertahankan dalam keadaan ekstrakromosomal maka vektor-vektor plasmid yang diperlukan yang mampu mereplikasi di host jamur.
Empat jenis vektor plasmid telah dikembangkan: plasmid ragi episomal (YEps), plasmid ragi replikasi (YRps), sentromer plasmid ragi (YCps), dan kromosom buatan ragi (YACs).
Sequencing & Mutagenesis
SEKUENSING DNA DAN MUTAGENESIS
By : Witiyasti Imaningsih
SEKUENSING DNA
Metode untuk menentukan urutan-urutan basa nukleotida(A,C,G, dan T) dalam suatu gen dan asam nukleat.
Analisis sekuen merupakan suatu teknik yang dianggap paling baik untuk melihat keanekaragaman hayati suatu kelompok organisme
Pendukung utama :
1. enzim restriksi
2. elektroforesis gel
3. kloning
4. teknik kimia (Maxem-Gilbert),teknik dideoksinukleotida (Sanger),
Teknik kimia (Allan Maxem dan Walter Gilbert)
Prinsip : degradasi struktur kimia DNA
Ke(-) : DNA yang disintesa < 250 nukleotida
Ke(+) : Menggunakan bahan kimia yg mudah diperoleh
Lanjutan…
Menggunakan 4 reaksi kimia yang berbeda untuk memisahkan rantai DNA
Metode ini memerlukan label radioaktif pada satu ujung dan pemurnian fragmen DNA yang akan disekuens. Sehingga sebuah seri dari fragmen yang dilabel dihasilkan dari ujung yang diradiolabel ke situs pemutusan pertama pada tiap molekul.
Fragmen pada ke-empat reaksi diatur bersebelahan pada gel elektroforesis untuk pemisahan berdasarkan ukuran. Untuk memvisualisasi fragmen, gel diekspos kepada X-ray film untuk autoradiografi.
menghasilkan sebuah seri band yang gelap yang masing-masing mewakili fragmen DNA yang diradiolabel.
Metode Dideoxy (Sanger)
Chain terminator method : ujung 3’ OH tidak dapat membentuk polimer pada ujung ddNTP
Campuran dari semua dNTP
dATP, dGTP, dCTP, dTTP
Campuran dari semua ddN TP dlm jumlah terbatas, ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP
Senyawa yg diperlukan :
Primer : komplementer dg DNA yg akan disekuen
Template : dapt berupa utas tunggal/ganda
DNA Polimerase
2′,3′-Dideoksiribonukleosida trifosfat:
2′,3′-Dideoksiribotimidin trifosfat(ddTTP) ii. 2′,3′-Dideoksiribositidin trifosfat(ddCTP) iii. 2′,3′-Dideoksiriboadenosin trifosfat(ddATP) iv. 2′,3′-Dideoksiriboguanosin trifosfat(ddGTP)
Setelah fragmen DNA dipisah menjadi 4 reaksi paralel dan diperoleh rantai template dengan proses denaturasi, kemudian dipisah oleh elektroforesis gel poliakrilamid dan posisinya akan dideteksi oleh autoradiografi. Fragmen terpendek akan pindah ke jarak terjauh dan mengarah ke anoda.
Teknik sekuensing otomatis
Penggunaan pewarna fluoresen untuk mendeteksi DNA
Pemisahan produk -dari reaksi yang 4 tadi- menggunakan gel tunggal atau tabung kapiler.
Menggunakan fotosel untuk mendeteksi pewarna fluoresen tadi.
Transfer langsung dari fotosel ke komputer, sehingga dapat dilakukan analisis, rekaman, dan presentasi hasil secara otomatis.
MUTAGENESIS
Deletion mutagenesis
Site-directed mutagenesis
PCR mutagenesis
Salah satu keuntungan dapat diisolasi dan dikloningnya gen adalah kemudahan untuk memodifikasi gen (sekuen as.amino, menyisipkan gen buatan) ke dlm protein melalui teknologi DNA rekombinan.
Mutagenesis digunakan untuk :
Mempelajari hubungan antara struktur protein dan fungsi biologi
Mengkarakterisasi sekuen promoter
Sekuen DNA spesifik diperlukan utk menjelaskan karakteristik sekuen promoter
Deletion mutagenesis (mutagenesis delesi) merupakan teknik yg sederhana dengan menghilangkan sekuen dari kedua ujung dari klon cDNA menggunakan enzim seperti exonuclease III (memotong rantai nukleotida dari arah 3 '-ke-5' ). Dengan waktu inkubasi tertentu enzim ini akan menghilangkan urutan DNA insert sehingga menghasilkan fragmen lebih pendek. Enzim lain, nuklease S1 (Nuklease kacang hijau) digunakan untuk menumpulkan ujung untai DNA. Setelah itu, plasmid rekombinan diligasi kembali dan digunakan untuk transformasi bakteri. Metode ini umumnya digunakan untuk memasukkan urutan cDNA yang besar, juga digunakan untuk menghapus coding sequence untuk menghapus gugus karboksil atau ujung amino dan menghasilkan potongan protein.
Site-directed mutagenesis
Merupakan teknik yang sangat memerlukan energi dimana perubahan situs tertentu pada sekuen DNA dihasilkan secara invitro, sebagai contoh untuk merubah sisa asam amino kedalam bentuk lain dengan merubah codon sequence dalam urutan gen.
SDM juga digunakan untuk merekayasa protein untuk berbagai tujuan seperti :
Peningkatan kestabilan, merubah kespesifikan dan mengurangi toksisitas.
Oligonucleotide-based mutagenesis is the most commonly used method to introduce mutations in coding sequence = site-direct mutagenesis
PCR mutagenesis dapat digunakan untuk menghasilkan delesi atau mutasi titik.
Memerlukan primer : forward dan reverse
By : Witiyasti Imaningsih
SEKUENSING DNA
Metode untuk menentukan urutan-urutan basa nukleotida(A,C,G, dan T) dalam suatu gen dan asam nukleat.
Analisis sekuen merupakan suatu teknik yang dianggap paling baik untuk melihat keanekaragaman hayati suatu kelompok organisme
Pendukung utama :
1. enzim restriksi
2. elektroforesis gel
3. kloning
4. teknik kimia (Maxem-Gilbert),teknik dideoksinukleotida (Sanger),
Teknik kimia (Allan Maxem dan Walter Gilbert)
Prinsip : degradasi struktur kimia DNA
Ke(-) : DNA yang disintesa < 250 nukleotida
Ke(+) : Menggunakan bahan kimia yg mudah diperoleh
Lanjutan…
Menggunakan 4 reaksi kimia yang berbeda untuk memisahkan rantai DNA
Metode ini memerlukan label radioaktif pada satu ujung dan pemurnian fragmen DNA yang akan disekuens. Sehingga sebuah seri dari fragmen yang dilabel dihasilkan dari ujung yang diradiolabel ke situs pemutusan pertama pada tiap molekul.
Fragmen pada ke-empat reaksi diatur bersebelahan pada gel elektroforesis untuk pemisahan berdasarkan ukuran. Untuk memvisualisasi fragmen, gel diekspos kepada X-ray film untuk autoradiografi.
menghasilkan sebuah seri band yang gelap yang masing-masing mewakili fragmen DNA yang diradiolabel.
Metode Dideoxy (Sanger)
Chain terminator method : ujung 3’ OH tidak dapat membentuk polimer pada ujung ddNTP
Campuran dari semua dNTP
dATP, dGTP, dCTP, dTTP
Campuran dari semua ddN TP dlm jumlah terbatas, ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP
Senyawa yg diperlukan :
Primer : komplementer dg DNA yg akan disekuen
Template : dapt berupa utas tunggal/ganda
DNA Polimerase
2′,3′-Dideoksiribonukleosida trifosfat:
2′,3′-Dideoksiribotimidin trifosfat(ddTTP) ii. 2′,3′-Dideoksiribositidin trifosfat(ddCTP) iii. 2′,3′-Dideoksiriboadenosin trifosfat(ddATP) iv. 2′,3′-Dideoksiriboguanosin trifosfat(ddGTP)
Setelah fragmen DNA dipisah menjadi 4 reaksi paralel dan diperoleh rantai template dengan proses denaturasi, kemudian dipisah oleh elektroforesis gel poliakrilamid dan posisinya akan dideteksi oleh autoradiografi. Fragmen terpendek akan pindah ke jarak terjauh dan mengarah ke anoda.
Teknik sekuensing otomatis
Penggunaan pewarna fluoresen untuk mendeteksi DNA
Pemisahan produk -dari reaksi yang 4 tadi- menggunakan gel tunggal atau tabung kapiler.
Menggunakan fotosel untuk mendeteksi pewarna fluoresen tadi.
Transfer langsung dari fotosel ke komputer, sehingga dapat dilakukan analisis, rekaman, dan presentasi hasil secara otomatis.
MUTAGENESIS
Deletion mutagenesis
Site-directed mutagenesis
PCR mutagenesis
Salah satu keuntungan dapat diisolasi dan dikloningnya gen adalah kemudahan untuk memodifikasi gen (sekuen as.amino, menyisipkan gen buatan) ke dlm protein melalui teknologi DNA rekombinan.
Mutagenesis digunakan untuk :
Mempelajari hubungan antara struktur protein dan fungsi biologi
Mengkarakterisasi sekuen promoter
Sekuen DNA spesifik diperlukan utk menjelaskan karakteristik sekuen promoter
Deletion mutagenesis (mutagenesis delesi) merupakan teknik yg sederhana dengan menghilangkan sekuen dari kedua ujung dari klon cDNA menggunakan enzim seperti exonuclease III (memotong rantai nukleotida dari arah 3 '-ke-5' ). Dengan waktu inkubasi tertentu enzim ini akan menghilangkan urutan DNA insert sehingga menghasilkan fragmen lebih pendek. Enzim lain, nuklease S1 (Nuklease kacang hijau) digunakan untuk menumpulkan ujung untai DNA. Setelah itu, plasmid rekombinan diligasi kembali dan digunakan untuk transformasi bakteri. Metode ini umumnya digunakan untuk memasukkan urutan cDNA yang besar, juga digunakan untuk menghapus coding sequence untuk menghapus gugus karboksil atau ujung amino dan menghasilkan potongan protein.
Site-directed mutagenesis
Merupakan teknik yang sangat memerlukan energi dimana perubahan situs tertentu pada sekuen DNA dihasilkan secara invitro, sebagai contoh untuk merubah sisa asam amino kedalam bentuk lain dengan merubah codon sequence dalam urutan gen.
SDM juga digunakan untuk merekayasa protein untuk berbagai tujuan seperti :
Peningkatan kestabilan, merubah kespesifikan dan mengurangi toksisitas.
Oligonucleotide-based mutagenesis is the most commonly used method to introduce mutations in coding sequence = site-direct mutagenesis
PCR mutagenesis dapat digunakan untuk menghasilkan delesi atau mutasi titik.
Memerlukan primer : forward dan reverse
Langganan:
Postingan (Atom)
