Sequencing & Mutagenesis

SEKUENSING DNA DAN MUTAGENESIS
By : Witiyasti Imaningsih
SEKUENSING DNA
Metode untuk menentukan urutan-urutan basa nukleotida(A,C,G, dan T) dalam suatu gen dan asam nukleat.
Analisis sekuen merupakan suatu teknik yang dianggap paling baik untuk melihat keanekaragaman hayati suatu kelompok organisme
Pendukung utama :
1. enzim restriksi
2. elektroforesis gel
3. kloning
4. teknik kimia (Maxem-Gilbert),teknik dideoksinukleotida (Sanger),
Teknik kimia (Allan Maxem dan Walter Gilbert)
Prinsip : degradasi struktur kimia DNA
Ke(-) : DNA yang disintesa < 250 nukleotida
Ke(+) : Menggunakan bahan kimia yg mudah diperoleh


Lanjutan…
Menggunakan 4 reaksi kimia yang berbeda untuk memisahkan rantai DNA
Metode ini memerlukan label radioaktif pada satu ujung dan pemurnian fragmen DNA yang akan disekuens. Sehingga sebuah seri dari fragmen yang dilabel dihasilkan dari ujung yang diradiolabel ke situs pemutusan pertama pada tiap molekul.
Fragmen pada ke-empat reaksi diatur bersebelahan pada gel elektroforesis untuk pemisahan berdasarkan ukuran. Untuk memvisualisasi fragmen, gel diekspos kepada X-ray film untuk autoradiografi.
menghasilkan sebuah seri band yang gelap yang masing-masing mewakili fragmen DNA yang diradiolabel.
Metode Dideoxy (Sanger)
Chain terminator method : ujung 3’ OH tidak dapat membentuk polimer pada ujung ddNTP
Campuran dari semua dNTP
dATP, dGTP, dCTP, dTTP
Campuran dari semua ddN TP dlm jumlah terbatas, ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP
Senyawa yg diperlukan :
Primer : komplementer dg DNA yg akan disekuen
Template : dapt berupa utas tunggal/ganda
DNA Polimerase


2′,3′-Dideoksiribonukleosida trifosfat:
2′,3′-Dideoksiribotimidin trifosfat(ddTTP) ii. 2′,3′-Dideoksiribositidin trifosfat(ddCTP) iii. 2′,3′-Dideoksiriboadenosin trifosfat(ddATP) iv. 2′,3′-Dideoksiriboguanosin trifosfat(ddGTP)
Setelah fragmen DNA dipisah menjadi 4 reaksi paralel dan diperoleh rantai template dengan proses denaturasi, kemudian dipisah oleh elektroforesis gel poliakrilamid dan posisinya akan dideteksi oleh autoradiografi. Fragmen terpendek akan pindah ke jarak terjauh dan mengarah ke anoda.

Teknik sekuensing otomatis
Penggunaan pewarna fluoresen untuk mendeteksi DNA
Pemisahan produk -dari reaksi yang 4 tadi- menggunakan gel tunggal atau tabung kapiler.
Menggunakan fotosel untuk mendeteksi pewarna fluoresen tadi.
Transfer langsung dari fotosel ke komputer, sehingga dapat dilakukan analisis, rekaman, dan presentasi hasil secara otomatis.
MUTAGENESIS
Deletion mutagenesis
Site-directed mutagenesis 
PCR mutagenesis

Salah satu keuntungan dapat diisolasi dan dikloningnya gen adalah kemudahan untuk memodifikasi gen (sekuen as.amino, menyisipkan gen buatan) ke dlm protein melalui teknologi DNA rekombinan.
Mutagenesis digunakan untuk :
Mempelajari hubungan antara struktur protein dan fungsi biologi
Mengkarakterisasi sekuen promoter
Sekuen DNA spesifik diperlukan utk menjelaskan karakteristik sekuen promoter

Deletion mutagenesis (mutagenesis delesi) merupakan teknik yg sederhana dengan menghilangkan sekuen dari kedua ujung dari klon cDNA menggunakan enzim seperti exonuclease III (memotong rantai nukleotida dari arah 3 '-ke-5' ). Dengan waktu inkubasi tertentu enzim ini akan menghilangkan urutan DNA insert sehingga menghasilkan fragmen lebih pendek. Enzim lain, nuklease S1 (Nuklease kacang hijau) digunakan untuk menumpulkan ujung untai DNA. Setelah itu, plasmid rekombinan diligasi kembali dan digunakan untuk transformasi bakteri. Metode ini umumnya digunakan untuk memasukkan urutan cDNA yang besar, juga digunakan untuk menghapus coding sequence untuk menghapus gugus karboksil atau ujung amino dan menghasilkan potongan protein.

Site-directed mutagenesis

Merupakan teknik yang sangat memerlukan energi dimana perubahan situs tertentu pada sekuen DNA dihasilkan secara invitro, sebagai contoh untuk merubah sisa asam amino kedalam bentuk lain dengan merubah codon sequence dalam urutan gen.
SDM juga digunakan untuk merekayasa protein untuk berbagai tujuan seperti :
Peningkatan kestabilan, merubah kespesifikan dan mengurangi toksisitas.
Oligonucleotide-based mutagenesis is the most commonly used method to introduce mutations in coding sequence = site-direct mutagenesis

PCR mutagenesis dapat digunakan untuk menghasilkan delesi atau mutasi titik.
Memerlukan primer : forward dan reverse