klonning gen selain e.coliii

KLONING GEN SELAIN DENGAN E.COLI

Untuk percobaan banyak akan lebih mudah untuk menggunakan E. coli sebagai penerima untuk gen kloning dari eukariota atau prokariota lain.
Transformasi mudah dan tersedia berbagai macam vektor yang mudah digunakan. Namun, penggunaan E. coli tidak selalu praktis karena tidak memiliki beberapa jalur biokimia tambahan yang penting untuk ekspresi fenotipik fungsi tertentu, misalnya degradasi senyawa aromatik, sintesis antibiotik, patogenisitas,sporulasi, dll

Dalam keadaan seperti itu,
gen harus dikloning kembali menjadi spesies yang serupa
(asal).

Syarat untuk kloning gen dalam
inang baru.
Pertama, harus ada sebuah metode untuk
memperkenalkan DNA yang diinginkan yang berpotensi sbg
penerima.
Metode yang tersedia meliputi transformasi,
konjugasi, dan elektroporasi,
Kedua,DNA yang diintroduksi perlu
dipelihara dalam inang yg baru.
sebagai replicon melalui lingkungan baru atau diintegrasikan ke dalam kromosom atau plasmid yang sudah ada sebelumnya.
Akhirnya, penyerapan dan pemeliharaan kloning gen hanya akan dideteksi jika diekspresikan.
Jadi ketidakmampuan untuk mendeteksi kloning gen dalam bakteri baru bisa disebabkan oleh kegagalan untuk memperkenalkan gen, untuk mempertahankan atau untuk mengekspresikan, atau kombinasi faktor-faktor tersebut.

DNA dapat ditransfer diantara berbagai strain
E. coli oleh tiga metode klasik konjugasi,
transduksi, dan transformasi, serta
dengan metode terbaru dari elektroporasi
Transformasi dalam organisme berbeda
dalam beberapa hal dari E. coli.
Pertama, dengan pengecualian
Neisseria gonorrhoeae, kompetensi untuk transformasi
adalah transient phenomenon.
Kedua, transformasi
dapat disequen secara independen, seperti Bacillus subtilis
dan Acinetobacter calcoaceticus, tetapi spesies lain
(Hemophilus influenzae, N. gonorrhoeae) itu tergantung
pada keberadaan spesific uptake sequence.

Ketiga,
mekanisme transformasi alam melibatkan
pembelahannuklease dari DNA dan degradasi dari salah satu dari dua alur sehingga terbentuk untai tunggal yang bisa masuk sel.

developed specialized methods for overcoming this problem (see Box. 10.1). For work with other species, electroporation (see p. 25) offers a much simpler
alternative although the efficiency may be very low.
For example, in Methanococcus voltae electroporation
yielded only 102 transformants/μg plasmid DNA (Tumbula & Whitman 1999)

Cloning in Gram-negative bacteria other than E. coli
Dalam keadaan normal,
E. coli akan digunakan sebagai inang sementara untuk transformasi
ligasi dan screening
plasmid rekombinan. Oleh karena itu, vektor harus dapat mereplikasi pada E. coli sebaik pada shuttle vektor
atau menggunakan broad-host-range plasmid sebagai vektor.
Jika
sebuah plasmid kecil dapat diisolasi dari bakteri
yang diinginkan, maka mudah untuk menyambungnya ke dalam vektor E. coli untuk menghasilkan shuttle vektor. Sebagai contoh adalah vektor yang digunakan dalam Pasteurella (Bills et al 1993).,
Desulfovibrio (Rousset et al 1998)., Dan Thermus
(De Grado et al 1999)..

Dengan broad-host-range plasmid, ada
probabilitas tinggi bahwa marker yang dipilih akan diekspresikan
di Inang baru. Namun, secara alami
plasmid yang ada tidak memenuhi semua kriteria untuk
vektor ideal, yaitu:
• ukuran kecil:
• memiliki beberapa selectable marker;
• mpembatasanmiliki situs yang unik untuk beberapa enzim restriksi

Akibatnya, plasmid alami telah banyak
diubah, tetapi yang paling mendekati
ditemukan dalam E. coli vektor standar.

Cloning in Gram-positive bacteria
Pada bakteri gram positif, komposisi dasar genome adalah <30% GC hingga >70% GC.
Dengan adanya perbedaan dalam isi GC,
kodon yang dipilih dan peraturan sinyal yang digunakan oleh
organisme di salah satu ujung spektrum % GC tidak akan
diterima oleh organisme di ujung lain, berarti bahwa tidak ada kendaraankloning universal
untuk digunakan dengan semua bakteri Gram-positif.

Organisme high-GC (ex.Streptomycetes) dan lainnya untuk organisme low-GC (Bacillus, Clostridium,
dan Staphylococcus dan the lactic acid bacteria
Streptococcus, Lactococcus, and Lactobacillus)

KLONING DI SACCHAROMYCES CEREVISIAE
dan jamur
Ada sejumlah alasan untuk kloning
DNA dalam S. cerevisiae
Ketika teknologi DNA rekombinan pertama kali diterapkan pada jamur pada akhir tahun 1970 organisme pilihan adalah ragi Saccharomyces cerevisiae. Pada saat itu
tujuan utama kloning adalah untuk memahami
gen tertentu apa yang dilakukan di vivo
pengembangan metodologi sekuensing DNA memfasilitasi identifikasi unsur-unsur yang berbeda yang mengontrol ekspresi gen pada jamur

Alasan sekunder untuk kloning dalam ragi adalah untuk memahami fungsi-fungsi seluler yang unik untuk eukariota seperti
mitosis, meiosis, transduksi sinyal, diferensiasi selular obligat, dll
Saat ini, ada alasan berbeda untuk kloning di S. cerevisiae dan jamur lainnya.

Alasan kedua untuk kepentingan saat ini dalam manipulasi gen pada jamur adalah kelebihan produksi protein nilai komersial.
Jamur menawarkan sejumlah keunggulan, seperti kemampuan untuk glycosylate protein, tidak adanya oxins t pyrogenic, dan dalam Pichia pastoris caseof dengan ragi methylotrophic, kemampuan untuk mendapatkan hasil yang sangat tinggi dari protein rekombinan.
Ragi dan jamur lainnya banyak digunakan dalam makanan dan DNA rekombinan productionof
teknologi dapat digunakan untuk meningkatkan sifat yang diinginkan mereka.
Alasan ketiga untuk kepentingan saat ini dalam aplikasi teknologi DNA rekombinan dalam ragi adalah kemampuan untuk mengkloning potongan DNA yang sangat besar, merupakan persyaratan penting bagi banyak-genom seluruh studi. Meskipun tidak ada batasan teoritis untuk ukuran DNA yang dapat dikloning dalam plasmid bakteri dalam prakteknya ditemukan bahwa menyisipkan besar menyebabkan ketidakstabilan struktural dan yg tdk suka bergaul dgn orang lain.
Vektor ragi tertentu (YACs, hal 213) dapat menerima menyisipkan lebih besar dari 1 Mb, jauh lebih besar dari yang ditemukan di BAC dan PAC. Meskipun YACs awal memiliki kecenderungan untuk menjadi tidak stabil masalah ini sebagian besar telah eliminatedin generasi baru YACs.
Jamur tidak alami transformable dan
metode khusus yang diperlukan untuk memperkenalkan
eksogen DNA
Seperti E.coli jamur secara alamiah dapat Tidak ditranform, UNTUK memperkenalkan DNA Asing digunakan jamur buatan (Rekayasa).
Salah Satu metodenya adl speroplas (sel berdinding Tidak) Yang Pertama kali dikembangkan UNTUK S. cerevisieae
PADA METODE ini, Dinding sel dihilangkan dg menggunakan enzim, speroplast yg dihasilkan etilen glikol difusi menggunakan DENGAN DNA murah CaCl2.
Speroplas kemudian dibiarkan UNTUK membentuk Dinding sel baru PADA media agar-agar penstabil mengandung 3%.
Langkah tersebut cara membuat sel Penerimaan Lebih Mudah.
Elektroporasi menyediakan alternatif yg Lebih Mudah utk penggunaan speroplast. Sel ditransformasi dg elektroporasi diseleksi dpt pd permukaan media Padat.
METODE speroplast murah elektoporasi Sudah digunakan PADA Berbagai Jenis ragi murah jamur.
DNA dpt diintroduksikan ke dlm ragi jamur murah dg konjugasi Heinemann & Sprague (1989) dan Sikorski et al. (1990) menemukan bahwa plasmid enterobacterial, seperti R751 (IncPβ) dan F (incf), dapat memfasilitasi transfer plasmid dari E. coli untuk cerevisiae S. dan pombe Schizosaccharomyces.

Bakteri patogen Agrobacterium tumefaciens Tanaman gede yg mengandung plasmid, plasmid Ti
BAGIAN murah ini plasmid (yaitu DNA T-) dapat ditransfer ke dlm scr konjugatif protoplas S. cerevisiae (Bundock et al, 1995.) murah beberapa jamur (De Groot et al. 1998). T-DNA dapat juga ditransfer kedlm HIFA murah konidia.
Eksogen DNA yang tidak dilakukan pada vektor
hanya dapat dipertahankan dengan integrasi ke dalam
kromosom

Ketika T-DNA dari Ti plasmid dari Agrobacterium ditransfer ke ragi, juga akan memasukkan di bagian yang berbeda dari genom dengan rekombinasi tidak sah (Bundock & Hooykaas 1996).
Berbagai jenis vektor telah
dikembangkan untuk digunakan dalam S. cerevisiae
Jika DNA heterolog diperkenalkan ke jamur harus dipertahankan dalam keadaan ekstrakromosomal maka vektor-vektor plasmid yang diperlukan yang mampu mereplikasi di host jamur.
Empat jenis vektor plasmid telah dikembangkan: plasmid ragi episomal (YEps), plasmid ragi replikasi (YRps), sentromer plasmid ragi (YCps), dan kromosom buatan ragi (YACs).