PEMINDAHAN GEN
TRANSFORMASI : hanya genom yang keluar (diabsorbsi dari lingkungan)
KONJUGASI : dimediasi oleh plasmid, harus ada penempelan
TRANSDUKSI : pemindahan gen dengan bantua virus

Bakterial Conjugation :
Prinsip : memerlukan kontak antar bakteri. Tidak dapat terjadi mutasi balik secara konstan. Bakteri menggunakan pilus (phili) untuk transfer genetik. Pilus bakteri donor akan menempel pada bakteri resipien kemudia terbentuk jembatan konjugasi dari ruang sel bakteri sehingga terjadilah pemindahan gen dan pembentukan plasmid baru.
Yang digunakan adalah plasmid karena kromosom memiliki ukuran gen dengan bp yang lebih tinggi sehingga proses pemindahannya akan memerlukan waktu yang lama, sedangkan proses matting hanya berlangsung sebentardimana fertility factor terdapat pada ujung kromosom sebelem F dapat ditransfer ke resepien, perkawinan terhenti & donot tidak dapat/jarang menjadi F. Integrasi F faktor bersifat pseudo random (dapat menempel dimana saja).
Bakteri memerlukan feromon untuk mengekspresikan gen tra. 1 feromon akan memicu pembetukan 1 plasmid yang transmisible. Peranan feromon pada resepien terdapat pada kromosom dan pada pendonor Tra A mengekspresikan transkipsi en. Tra C mengkodekan protein dipermukaan sel yang dapat mengenali feromon. Sehingga terjadi matting dimana feromon masuk melalui sistem oligopeptida permease. Feromon mengikat TraA (dlepas dari DNA) memicu sintesis Tra E.

Klonning selain pada E.coli :
Salah satunya dengan menggunakan saccharomyces. Alasan menggunakan yeast adalah : mewakili eukariot, sequencing lengkap sehingga mudah untuk digunakan, rekayasa dapat dilakukan dengan cara menghilangkan gen spesifik dari yeas menggunakan plasmid yeast, siklus hidunya juga cepat sehingga sintesis biologisnya juga cepat, pda proses rekombinasi homolog gen kedalam plasmid yeast memungkinkan terjadinya intregasi menghasilkan 2 kopi.
Fungi berfilamen inang sbg ekspresi ;
1. Tumbuhnya cepat 2. Media pertumbhannya murah. 3. Level ekspresinya banyak. 4. Kapasitas sekresinya besar. 5. Dapat melakukan tasonal modification

A.tumefaciens : merupakan bakteri yang menyebabkan tumor pada tumbuhan dikotiledon yang disebabkan adanya plasmid Ti. Merupakan media untuk memasukkan DNA asing pada tanaman. pada dasarnya bakteri mentransfer bagian dari Dna nya sendiri ke tanaman. Dna ini akan berintregasi ke genome tanaman yang menyebabkan terjadinya tumor dan berasosiai utuk memodifikasi / merubah metabolisme. A. Tumefaciens memiliki plasmid Ti yaitu plasmid yang digunakan untuk mentransfer gen yang diinginkan. Ketika terintregarasi pada sel tanaman, makan TDNA akan mengkode : produksi sitokini, produksiasam indoleacatic dan sintesi dan pelepasan hasil metabolisme.

SEKUENSING DNA
Merupakan metode untuk menentukan urtan2 basa nukleotida dalam satu gen danasam nukleat. Analisis sekuen meupaka suatu teknik yang dianggap paling baik untuk melihat keanekaragaman hayati suatu kelompk mikroorganisme.

Teknik kimia
-prinsipnya adalah degrada struktur kimia DNA. Kekurangan dari metode ini adalah Dna yang disntesin kurang dari <250 bp. Dan kelebihannya adalah menggunakan bahan kima yang mudah didapat. Metode ini memerlukan label radioaktif pada ujung satu dan pemurnian framgen DNA yang akan disekuen. Fragmen pada ke-empat reaksi diatur bersebelahan pada gel elektroforesis untuk pemisahan berdasarkan ukuran. Untuk memvisualisasi fragmen, gel diekspos kepada X-ray film untuk autoradiografi. menghasilkan sebuah seri band yang gelap yang masing-masing mewakili fragmen DNA yang diradiolabel.
Metode dedioxy
Chain terminator method : ujung 3’ OH tidak dapat membentuk polimer pada ujung ddNTP
Campuran dari semua dNTP
dATP, dGTP, dCTP, dTTP
Campuran dari semua ddN TP dlm jumlah terbatas, ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP
Senyawa yg diperlukan :
Primer : komplementer dg DNA yg akan disekuen
Template : dapt berupa utas tunggal/ganda
DNA Polimerase
2′,3′-Dideoksiribonukleosida trifosfat:
2′,3′-Dideoksiribotimidin trifosfat(ddTTP)
ii. 2′,3′-Dideoksiribositidin trifosfat(ddCTP)
iii. 2′,3′-Dideoksiriboadenosin trifosfat(ddATP)
iv. 2′,3′-Dideoksiriboguanosin trifosfat(ddGTP)
Setelah fragmen DNA dipisah menjadi 4 reaksi paralel dan diperoleh rantai template dengan proses denaturasi, kemudian dipisah oleh elektroforesis gel poliakrilamid dan posisinya akan dideteksi oleh autoradiografi.
Fragmen terpendek akan pindah ke jarak terjauh dan mengarah ke anoda.




















MUTAGENESIS
1. Deletion mutagenesis
2. Site-directed mutagenesis
3. PCR mutagenesis

Salah satu keuntungan dapat diisolasi dan dikloningnya gen adalah kemudahan untuk memodifikasi gen (sekuen as.amino, menyisipkan gen buatan) ke dlm protein melalui teknologi DNA rekombinan.
Mutagenesis digunakan untuk :
1. Mempelajari hubungan antara struktur protein dan fungsi biologi
2. Mengkarakterisasi sekuen promoter
3. Sekuen DNA spesifik diperlukan utk menjelaskan karakteristik sekuen promoter

DELETION MUTAGENESIS (mutagenesis delesi) merupakan teknik yg sederhana dengan menghilangkan sekuen dari kedua ujung dari klon cDNA menggunakan enzim seperti exonuclease III (memotong rantai nukleotida dari arah 3 '-ke-5' ). Dengan waktu inkubasi tertentu enzim ini akan menghilangkan urutan DNA insert sehingga menghasilkan fragmen lebih pendek. Enzim lain, nuklease S1 (Nuklease kacang hijau) digunakan untuk menumpulkan ujung untai DNA. Setelah itu, plasmid rekombinan diligasi kembali dan digunakan untuk transformasi bakteri. Metode ini umumnya digunakan untuk memasukkan urutan cDNA yang besar, juga digunakan untuk menghapus coding sequence untuk menghapus gugus karboksil atau ujung amino dan menghasilkan potongan protein.
Proses deletion mutagenesis : rekombinan plasmid à diinkubasi dngan exonuclease untuk memotong DNAàdiinkubasi dengan S1àdiligasi dengan ‘t4 DNA ligaseàplasmid ditransformasi.

SITE-DIRECTED MUTAGENESIS
Merupakan teknik yang sangat memerlukan energi dimana perubahan situs tertentu pada sekuen DNA dihasilkan secara invitro, sebagai contoh untuk merubah sisa asam amino kedalam bentuk lain dengan merubah codon sequence dalam urutan gen.
SDM juga digunakan untuk merekayasa protein untuk berbagai tujuan seperti :
Peningkatan kestabilan, merubah kespesifikan dan mengurangi toksisitas.
Oligonucleotide-based mutagenesis is the most commonly used method to introduce mutations in coding sequence = site-direct mutagenesis

PCR MUTAGENESIS dapat digunakan untuk menghasilkan delesi atau mutasi titik.
Memerlukan primer : forward dan reverse